豆瓣醬工業發酵過程中生物胺的生成規律

李東蕊，劉紅霞，吳劍榮，夏小樂*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫， 214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

豆瓣醬是一種中國傳統調味品，發酵過程經歷多個階段，期間多種微生物參與發酵反應[1-2]。豆瓣醬中含有豐富的營養物質，具有補中益氣，開胃健脾等功效。然而，目前工業規模豆瓣醬生產依舊是相對開放的發酵體系，環境因素容易對豆瓣醬產品質量穩定性產生一定影響，其中微生物代謝會造成有害物質的積累[3]，如產生生物胺、黃曲霉毒素等。

生物胺是一類具有生物活性且含氮的低分子量的有機化合物，主要通過微生物氨基酸脫羧作用產生[4-5]。生物胺具有促進DNA、RNA和蛋白質的合成，加速生物體的生長發育等作用，然而過量攝入可能會引發頭痛、中毒等健康問題，嚴重的甚至危及生命[6-7]。生物胺廣泛存在于幾乎所有的發酵食品中[8]，如發酵豆制品[9-10]、酒精飲料[11]、乳制品[12]等。它的生成受多種因素影響，如含水量、溫度、pH等，主要是通過影響產胺微生物或者氨基酸脫羧酶的活性來實現[13-14]。曾雪晴等[15]對不同種類豆瓣醬中生物胺含量與理化指標之間進行了分析，然而目前仍缺乏對豆瓣醬工業發酵過程中生物胺生成規律及其與品質指標之間關系的研究。

本研究主要探究豆瓣醬工業發酵過程中生物胺的生成規律，同時對生物胺與理化指標(含水量、pH、總酸、氨基態氮及鹽度)及氨基酸之間的相互作用和關系進行了研究和分析，在此基礎上，對控制豆瓣醬中生物胺含量及提高豆瓣醬品質進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵中的豆瓣醬樣品，四川某豆瓣醬廠。豆瓣醬生產及取樣點如圖1所示，每個批次取8個樣品，分別對應于0、2、5、8、14、20、26、32 d。

1-0 d;2-2 d;3-5 d;4-8 d;5-14 d;6-20 d;7-26 d;8-32 d圖1 豆瓣醬發酵過程和取樣點Fig.1 Fermentation and sampling processes of broadbean paste

標準品: 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺、亞精胺、1,7-二氨基庚烷，美國Sigma-Aldrich公司;丹磺酰氯,梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;乙腈(HPLC級)、丙酮、HCl、 NaOH、甲醛、AgNO3、鉻酸鉀等,中國醫藥集團化學試劑有限公司。

HITACHI chromaster高效液相色譜儀，日本日立公司；超聲波清洗儀(SB-4200DT)，寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫水槽(DK-8D)，上海精宏實驗設備有限公司；電子天平(AS220.R2)，波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne公司；pH計(FE28)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；臺式高速離心機(TG 1850-WS)，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物胺標準溶液的配制

參照GB 5009.208—2016[16],將樣品稀釋成不同質量濃度的標準品工作液,分別為1、2.5、5、10、15、25、50 mg/L。

1.2.2 樣品的前處理及生物胺檢測方法

樣品的前處理方法參照文獻[17]。標品及處理后的樣品按以下色譜條件進行進樣分析：

色譜柱為Diamonsil plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，流速0.80 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。流動相A為乙腈， B為超純水，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 豆瓣醬中理化指標及氨基酸的檢測

含水量的檢測參照GB 5009.3—2016[18]，pH的檢測參照文獻[19]，氨基酸態氮、總酸的測定參照GB 5009.235—2016[20]，食鹽的檢測參照GB/T 5009.40—2003[21]，氨基酸含量的檢測參照文獻[22]。

1.3 數據分析

每個實驗重復3次，數據表示為平均值±標準誤差。使用Origin 2016 軟件進行繪圖；使用SPSS 19.0 軟件對生物胺與理化指標(含水量、pH、總酸、氨基酸態氮和鹽度)和氨基酸進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 豆瓣醬發酵過程中生物胺含量變化

2.1.1 生物胺檢測的標準曲線

取生物胺標準品使用溶液，根據上述實驗方法進樣分析，以峰面積比為縱坐標，生物胺質量濃度為橫坐標，得到8種生物胺的線性回歸方程和相關系數R2，見表2。由實驗結果可知，8種生物胺的出峰時間表明此方法具有較好的分離效果。標準溶液質量濃度在1～50 mg/L線性范圍內，相關系數R2均大于0.999，表明8種生物胺質量濃度與峰面積之間均存在良好的線性關系。

表2 生物胺的出峰時間、線性方程及相關系數Table 2 Retention time, regression equations andcorrelation coefficients of biogenic amines

2.1.2 豆瓣醬發酵過程中生物胺含量的變化規律

豆瓣醬工業發酵主要有制曲、甜瓣子發酵及混合椒胚曬醬3個階段。本實驗前期對椒胚、曬醬中及曬醬結束階段的生物胺含量進行檢測，結果發現，生物胺含量在曬醬過程基本沒有變化，所以研究重點集中在豆瓣醬發酵過程中的制曲階段和甜瓣子發酵階段。

從圖2可以看出，在豆瓣醬工業發酵過程中，主要的生物胺是腐胺、亞精胺與精胺。總生物胺含量在制曲階段上升后，隨著加鹽溶液發酵的進行逐漸降低。色胺只在豆瓣醬發酵第8天被檢測到，且含量較低。腐胺在第0天為50.67 mg/kg；制曲結束后，迅速升至最大值134.96 mg/kg；在第5天驟降，這是由于添加了鹽溶液起到了一定的稀釋作用，同時部分腐胺可能轉化為亞精胺，隨著發酵的進行腐胺逐漸降低至26.42 mg/kg。而亞精胺與精胺則在第0天存在，制曲結束后降低至5 mg/kg以內，可能由于在制曲階段轉為腐胺的原因。在加鹽溶液進行發酵后，亞精胺與精胺逐漸增加至20 mg/kg左右，含量變化不明顯，可能由于腐胺在一定條件下作為前體物質轉化為亞精胺和精胺，這與上述所說腐胺含量隨著發酵的進行而逐漸降低結果相符合。

圖2 豆瓣醬發酵過程中生物胺的含量變化Fig.2 Changes of biogenic amine content during the fermentation of broad bean paste

2.2 豆瓣醬發酵過程中理化指標的變化及其與生物胺相關性分析

對豆瓣醬工業發酵過程中理化指標進行檢測，結果如圖3所示。豆瓣醬工業發酵過程中含水量在17.7%～ 43.97%之間變化，在制曲結束時，含水量急劇下降至17.7%，而在加鹽水進行發酵后，含水量又上升至40%以上。氨基態氮含量在整個發酵階段基本上呈逐漸上升趨勢，發酵結束達0.631 g/100 g?？偹嵩诎l酵過程中也呈逐漸上升趨勢，但在發酵結束時略微下降。而鹽度在發酵過程中變化不大，在9.2～9.52 g/100 g之間。pH在發酵過程由5.45逐漸下降至4.98，說明豆瓣醬工業發酵過程整體呈輕微酸性，符合微生物生成生物胺的pH條件[23]。

a-含水量;b-氨基態氮、總酸;c-鹽含量、pH圖3 豆瓣醬發酵過程中理化指標的變化Fig.3 Changes of physicochemical indexes during the fermentation of broad bean paste

對豆瓣醬工業發酵過程生物胺含量和理化指標進行相關性分析(person)，如表3所示。雙變量分析結果表明，腐胺則與含水量、pH、鹽度具有很大的相關性。而亞精胺與含水量、氨基態氮、總酸及鹽度均顯著相關?？偵锇泛颗c含水量、pH、氨基態氮、總酸及鹽度顯著相關。在低pH條件下，微生物為了抵抗酸脅迫，易于形成生物胺[24]，而豆瓣醬發酵過程總生物胺和腐胺與pH均呈現正相關，可能是由于豆瓣醬屬于開放式混菌發酵體系，反應較為復雜。

表3 豆瓣醬發酵過程中環境變量與生物胺的相關性Table 3 Correlations between environmental variablesand biogenic amines during the fermentation of thebroad bean paste

注：r為皮爾遜相關系數，P<0.05為顯著相關

2.3 豆瓣醬發酵過程中氨基酸含量的變化及其與生物胺相關性分析

生物胺的積累依賴于有豐富的氨基酸前體的存在，為了探究生物胺與其前體氨基酸的關系，對發酵過程中游離氨基酸含量進行檢測。從圖4可以看出，豆瓣醬工業發酵過程中主要游離氨基酸有谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬氨酸等。總游離氨基酸含量在制曲階段略有下降后，但隨著發酵的進行又逐漸上升。而精氨酸和鳥氨酸作為腐胺的前體氨基酸，在制曲階段急劇下降，這與之前得到的腐胺在制曲階段急速上升的結果一致。同時精氨酸在加鹽水發酵后上升至0.351 g/100 g，然后隨著發酵的進行逐漸降低，可能由于加鹽水發酵，腐胺的生成受到抑制導致精氨酸的積累，隨著發酵的進行又經AgDI途徑生成腐胺，并進一步在亞精胺合成酶的作用下生成亞精胺以及精胺。

對豆瓣醬工業發酵過程中生物胺與其前體物質進行相關性分析(表4)。結果表明，精氨酸作為腐胺的前體，與腐胺有一定的負相關性，與亞精胺顯著正相關；而腐胺作為亞精胺的前體與亞精胺也呈現一定的相關性；其他生物胺與其前體之間沒有顯著相關性。所以，在一定程度上，游離氨基酸作為生物胺的前體物質與生物胺之間有較強的聯系，控制豆瓣醬發酵過程中游離氨基酸的含量可能成為一種控制生物胺的手段。

圖4 豆瓣醬發酵過程中游離氨基酸含量Fig.4 Contents of free amino acids during the fermentation of broad bean paste

表4 豆瓣醬發酵過程中氨基酸與生物胺的相關性研究Table 4 Correlations between amino acids and biogenicamines during the fermentation of the broad bean paste

注：*表示在 0.05 水平(雙側)上顯著相關；**表示在0.01 水平(雙側)上顯著相關。

3 結論

為了探究豆瓣醬工業發酵過程中生物胺的生成規律，本研究采用高效液相色譜對豆瓣醬發酵過程中生物胺含量進行檢測，結果表明，豆瓣醬發酵過程中主要生物胺為腐胺、亞精胺與精胺；腐胺在第0天為50.67 mg/kg，制曲結束后，迅速升至最大值134.96 mg/kg，隨著發酵的進行腐胺逐漸降低至26.42 mg/kg。而亞精胺與精胺則在第0天存在，制曲結束后降低至5 mg/kg以內，隨后逐漸增加至20 mg/kg左右，變化不明顯。

本研究通過對理化參數和各種生物胺含量的相關分析，探究環境因素對各種生物胺的影響。在豆瓣醬發酵過程中，腐胺與含水量、pH、鹽含量具有很大的相關性；而亞精胺與含水量、氨基態氮、總酸及鹽含量均顯著相關?？偵锇泛颗c含水量、pH、氨基態氮、總酸及鹽含量顯著相關。而豆瓣醬在發酵過程中，精氨酸與腐胺有一定的相關性，與亞精胺顯著相關；而腐胺與亞精胺呈顯著相關，其他生物胺與其前體之間并沒有顯著相關性。然而豆瓣醬發酵是一個復雜開放的混菌發酵體系，因此想要清晰生物胺形成規律的具體原因，未來需進一步研究微生物對發酵豆瓣醬中生物胺生成的具體影響，以期從微生物角度去調控生物胺的含量。