雷替曲塞對裸鼠皮下人結腸癌細胞移植瘤生長的影響及機制

賀許良，曾良玉，易小龍，張樹友

1長沙醫學院附屬株洲市人民醫院，湖南株洲412000；2南華大學附屬南華醫院

結直腸癌是消化道常見腫瘤，據美國癌癥協會數據統計，結直腸癌的發病率居惡性腫瘤第三位[1]。目前，結直腸癌的治療仍以手術為主，但術后復發率及轉移率均較高，特別是對于中晚期患者而言，手術治療效果較差，多依賴于化學治療[2，3]。雷替曲塞是新型抗葉酸制劑，能夠通過競爭葉酸鹽轉運載體進入細胞，抑制胸苷酸合酶，損傷DNA，用于惡性腫瘤的抑制治療已取得一定的臨床療效[4，5]。然而，雷替曲塞抑制腫瘤生長的具體分子生物學機制尚不完全明確。Bax、Caspase-3、p53均與細胞凋亡密切相關，可反映腫瘤的生長狀態。2018年3月～2019年6月，我們觀察了雷替曲塞對人結腸癌細胞SW480移植瘤Bax、Caspase-3、p53 mRNA及蛋白的影響，探討雷替曲塞抑制腫瘤生長的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 1月齡BALB/c雌性裸鼠20只，體質量15～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼養環境清潔，室溫(25.0±3.0)℃，自由進食進水。人結腸癌細胞SW480購自上海一研生物科技有限公司。雷替曲塞(2 mg/支)由正大天晴藥業集團股份有限公司生產，RPMI1640培養基由友康基業生物科技(北京)有限公司生產，胎牛血清購自維森特生物技術(南京)有限公司，兔抗人Bax、p53、Caspase-3單克隆抗體購自美國ABcam公司，羊抗兔β-actin內參、BCA蛋白定量試劑盒、EC發光檢測試劑盒等購自南京凱基生物科技有限公司。自動酶標儀購自美國Bio Tek儀器有限公司，RT-PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立與分組 將SW480細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞，加入0.25%胰酶蛋白酶消化，制成1×107/mL的單細胞懸液。取0.2 mL單細胞懸液注射于裸鼠腋下皮膚。每天觀察裸鼠的狀態，1周后裸鼠皮下出現直徑5 mm左右的結節，表明移植瘤模型建立成功。按照隨機數表法將20只移植瘤模型鼠隨機分為實驗組和對照組各10只，實驗組注射雷替曲塞7.5 mg/(kg·d)，對照組注射生理鹽水0.5 mL/d，連續注射5 d，休息2 d 后再注射5 d，繼續喂養2 d。

1.3 動物一般狀況與腫瘤生長情況觀察 給藥期間密切觀察裸鼠的精神狀態、進食情況、活動情況。給藥結束并繼續喂養2 d后處死裸鼠，連同包膜完整剝離出腫瘤組織。稱取裸鼠體質量和瘤體質量，計算實驗組抑瘤率后-80 ℃保存備用。抑瘤率=(對照組平均瘤體質量-實驗組平均瘤體質量)/對照組平均瘤體質量×100%。

1.4 腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取腫瘤組織，TRIzol法提取總RNA，測定RNA濃度后，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增引物由上海生工生物工程有限公司設計及合成。引物序列：Bax上游5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′,下游5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；Capase-3上游5′-TGGAATTGATGCGTGATGTT-3′,下游5′-GGCAGGCCTGAATAATGAAA-3′；p53上游5′-CTGCCCTCAACAAGATGTTTTG-3′,下游5′-CTATCTGAGCAGCAGCGCTCATGG-3′；GAPDH上游5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5 腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取腫瘤組織，加入蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白總量。取80 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸變性5 min，迅速低溫冷卻后加樣，瓊脂糖凝膠電泳。切取含目的蛋白條帶的膠塊轉膜處理及TBST沖洗后，加入封閉液，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗，加入二抗，室溫孵育 1 h。TBST沖洗，凝膠成像儀曝光并顯色，測定條帶光密度值。以目的蛋白與內參β-actin蛋白光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組一般狀況與腫瘤生長情況比較 造模成功后，對照組逐漸出現腹水，進水、飲食量及活動明顯減少，體質量增加；實驗組除用藥30 min內精神較差、活動明顯較前減少而后逐漸恢復正常外，飲食量略有減少，進水正常。兩組體質量、瘤體重量比較見表1。實驗組抑瘤率為51.61%。

表1 兩組體質量、瘤體質量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 兩組腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達比較 見表2。

表2 兩組Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.3 兩組腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53蛋白表達水平比較 見表3。

表3 兩組Bax、Caspase-3、p53蛋白表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

結腸癌容易早期發生遠處轉移，嚴重影響患者預后。目前，手術切除腫瘤根治術仍是結腸癌的主要治療方法，但殺滅原位殘留或轉移的腫瘤細胞，需要有效的化療藥物。雷替曲塞為新一代的特異性胸苷酸合成酶抑制劑，具有水溶性，為一種喹唑啉葉酸鹽類似物，通過還原后的葉酸載體進行細胞內攝取，從而在葉酸基聚谷氨酸合成酶的代謝過程中，迅速代謝為系列多聚谷氨酸類化合物。這些代謝物具有更強抑制胸苷酸合成酶的活性，抑制癌細胞DNA的合成，從而促進癌細胞凋亡，且細胞內保留時間長更加利于發揮強力有效的細胞毒作用[6～9]。目前，雷替曲塞已逐步成為結直腸癌化療的一線用藥。

細胞凋亡是機體細胞發生的程序性死亡過程，受多種基因調控。相關研究顯示，Caspase蛋白酶是特異切割天冬氨酸位點的蛋白水解酶，在細胞凋亡過程中起關鍵作用，其中Caspase-3處于凋亡級聯反應下游，可通過滅活凋亡抑制因子、水解激活促凋亡因子Bid、直接降解細胞骨架相關蛋白等途徑引起細胞不可逆轉地凋亡[10]；Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白之一，定位于細胞質，當死亡信號將其激活后，活化的Bax可轉位到線粒體膜上，通過形成同源二聚體而導致線粒體膜通透性增大，釋放促凋亡因子，最終引起細胞凋亡[11]；p53作為一種凋亡活化基因，其除了能夠通過介導細胞信號轉導將應激信號傳入細胞，并作為轉錄因子促進下游目的基因的轉錄，實現短暫或長期阻滯細胞周期分化、DNA復制與修復而阻止癌細胞早期增殖的目的外，還可直接轉移定位于線粒體上，通過與Bcl-2或Bcl-xl的結合促使Bax游離并活化而發揮促細胞凋亡的作用[12]。本研究通過建立結腸癌裸鼠移植瘤模型，觀察雷替曲塞對腫瘤的抑制作用，發現實驗組腫瘤組織內促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及p53表達水平均較對照組明顯升高，且實驗組腫瘤質量明顯小于對照組，實驗組抑瘤率為51.61%。可見，雷替曲塞可上調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及p53表達,有效抑制移植瘤模型鼠體內人結腸癌移植瘤的生長。薛松等[10]研究發現，雷替曲塞能夠激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，推測雷替曲塞可能通過Caspase-3依賴的線粒體途徑誘導胃癌細胞凋亡，抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長。洪雷等[13]報道，雷替曲塞具有明顯抑制胃癌移植瘤生長的作用，其機制可能是通過上調p53表達從而誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯有關。馬世華等[14]研究發現，雷替曲塞可通過激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，介導Caspase-3凋亡級聯反應與線粒體膜通透性增大，釋放促凋亡因子，誘導胃癌細胞凋亡；雷替曲塞可能通過上調P53表達，增加人胃癌細胞株S期的比例，降低G0/G1期細胞比例，誘導細胞凋亡，進而抑制人胃癌細胞株生長。

綜上所述，雷替曲塞可通過調節Bax、Caspase-3和p53蛋白及其RNA的表達水平激活結腸癌細胞的凋亡通道，抑制裸鼠皮下人結腸癌細胞移植瘤的生長。