CXCR2在膀胱癌干細胞增殖、凋亡及侵襲轉移中的作用及機制

李順來，姜亭起，馬天加

1濟南市第五人民醫院，濟南250022；2山東大學第二醫院

膀胱癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤，其中以膀胱尿路上皮癌所占比例最大。雖然放化療以及靶向藥物的應用改善了早期膀胱癌患者的預后，但對于中晚期患者而言，腫瘤復發轉移率高，預后仍然較差；此外，化療耐藥也是導致膀胱癌治療效果不理想的另一個重要原因。研究證實，腫瘤干細胞是腫瘤復發轉移以及耐藥的主要原因[1]，然而其具體機制尚未完全闡明。探討膀胱癌干細胞在膀胱癌復發、轉移中的機制，對于降低中晚期患者的復發轉移率、改善預后極為重要。趨化因子受體2(CXCR2)是趨化因子受體家族中的一員，是CXC陽性趨化因子的公共受體[2]。CXCR2在腎癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均出現差異表達，且通過調控腫瘤細胞增殖、血管形成等促進腫瘤細胞的侵襲、轉移[3]。近年研究顯示，CXCR2在腫瘤干細胞的增殖以及侵襲、轉移中亦起著關鍵調控作用[4]。2017年10月～2019年2月，我們從膀胱癌組織中提取、培養腫瘤干細胞，采用慢病毒技術沉默干細胞中CXCR2基因的表達，觀察其對細胞增殖、侵襲、轉移能力的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 膀胱癌干細胞的組織來源 收集1例膀胱尿路上皮癌患者的新鮮腫瘤組織。納入標準：①首次手術經病理證實為膀胱尿路上皮癌；②術前未接受過放化療以及內分泌治療；③除膀胱癌以外，無其他惡性腫瘤病史；④無肝腎功能障礙以及傳染病史。本研究經濟南市第五人民醫院倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 膀胱癌干細胞的分離鑒定與CXCR2蛋白檢測 將新鮮腫瘤組織置于超凈工作臺內，去除脂肪、血管等非腫瘤組織，用眼科剪將腫瘤組織剪碎，加入1 mg/mL Ⅳ型膠原酶，37 ℃搖床上消化2 h。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基終止消化，用70 μm孔徑的細胞篩網過濾，2 000 r/min離心5 min，棄上清。加入含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的無血清培養基，倒置顯微鏡下觀察，2周左右開始形成懸浮細胞球，采用流式細胞儀分選CD44+膀胱癌干細胞，其余細胞標注為CD44-細胞，接種于無血清培養基中擴大培養。采用Western blotting法檢測CD44+與CD44-細胞的干細胞標志基因Oct4、Sox2蛋白表達，并檢測CXCR2蛋白表達。

1.3 膀胱癌干細胞的培養與分組、轉染 取對數生長期細胞，接種至6 cm培養皿中。將細胞分為sh-CXCR2組和sh-scramble組，sh-CXCR2組加入慢病毒轉染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒sh-scramble組加入慢病毒轉染試劑polybrene與對照scramble按照轉染說明書操作。置于37 ℃培養箱中培養8 h后，更換新的培養基繼續培養。

1.4 膀胱癌干細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板中。將細胞分為sh-CXCR2組和轉染對照組，每組設6個復孔。按照“1.3”方法進行慢病毒轉染，轉染72 h后，每孔更換150 μL新鮮培養基并加入30 μL MTS工作液，在37 ℃細胞培養箱中孵育2 h后，酶標掃描儀490 nm波長處測定吸光度值，細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.5 膀胱癌干細胞克隆形成能力觀察 采用軟瓊脂克隆形成實驗。1.2%瓊脂糖高溫高壓滅菌后放入42 ℃水浴中，加入等體積無血清培養基混勻，取2 mL瓊脂糖與無血清培養基混合液均勻鋪至6 cm培養皿中做為底層膠，放置4 ℃冰箱中冷卻至固態。按照“1.3”的方法對膀胱癌細胞進行分組、轉染。將2 mL高溫滅菌后的0.6%瓊脂糖與無血清培養基等體積混勻做為上層膠，取轉染72 h的膀胱癌干細胞以3×104/孔、100 μL培養基與37 ℃預熱的上層膠充分混勻，鋪至固態的底層膠上，置于細胞培養箱中培養14～16 d，顯微鏡下觀察，計數克隆球的形成數目并拍照。

1.6 膀胱癌干細胞凋亡率測算 細胞轉染72 h后，加入無EDTA的胰酶消化。PBS洗3次，按照說明書分別加入Binding Buffer、7-ADD、Annexin Ⅴ-APC染液。槍頭吹吸混勻后避光孵育10～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 膀胱癌干細胞轉移能力觀察 采用Transwell轉移實驗。細胞轉染72 h后，加入無EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液，聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分布于運動小室和侵襲小室的上下室之間，下室加入500 μL含體積分數為10%胎牛血清的完全培養基，上室加入5×104個細胞，37 ℃培養箱孵育6 h。顯微鏡觀察下室有明顯細胞時終止實驗，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木精染色。光鏡下觀察穿膜細胞數，隨機計數5個視野取平均值。

1.8 膀胱癌干細胞侵襲能力觀察 采用Boyden侵襲實驗。將“1.7”中的聚碳酸酯微孔膜侵襲小室濾膜上包被人工基底膠，其余步驟同上。

1.9 膀胱癌干細胞抗凋亡相關蛋白FOXO1A、Bcl-2及侵襲轉移相關蛋白MMP-2、MMP-9表達檢測 采用Western blotting法。細胞轉染72 h后，加入RIPA細胞裂解液裂解，用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸后-20 ℃保存備用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將電泳產物轉移到PVDF膜，8%脫脂奶粉封閉3 h。分別加入FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9一抗(稀釋濃度均為1∶500)孵育過夜，加入兔二抗和鼠二抗(稀釋濃度均為1∶8 000)孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發光底物曝光條帶，Image J軟件分析條帶光密度。以GAPDH作為內參，以目的蛋白與GAPDH光密度比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 膀胱癌干細胞的篩選鑒定結果及CXCR2蛋白表達情況 經流式細胞儀篩選出的CD44+膀胱癌干細胞約占全部細胞的2.37%。CD44+膀胱癌干細胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達均高于CD44-細胞(P均<0.05)，見表1。

表1 CD44+與CD44-膀胱癌干細胞中Oct4、Sox2、CXCR2蛋白表達比較

注：與CD44-細胞比較，#P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖率比較 sh-CXCR2組細胞增殖率為100%±1.54%，轉染對照組為48.41%±2.11%，sh-CXCR2組細胞增殖率低于轉染對照組(P<0.05)。

2.3 兩組克隆形成能力比較 轉染對照組克隆球形成數目為(23.47±1.97)個，sh-CXCR2組為(6.36±1.21)個，sh-CXCR2組克隆球形成數目少于轉染對照組(P<0.05)。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 sh-CXCR2組細胞凋亡率為7.41%±0.24%，轉染對照組為0.87%±0.18%，sh-CXCR2組細胞凋亡率高于轉染對照組(P<0.05)。

2.5 兩組細胞侵襲、轉移能力比較 Transwell實驗結果顯示，sh-CXCR2組穿膜細胞數為(33.17±5.48)個，轉染對照組為(249.38±9.57)個，sh-CXCR2組少于轉染對照組(P<0.05)。Boyden實驗結果顯示，sh-CXCR2組穿膜細胞數為(53.18±8.21)個，轉染對照組為(153.12±11.26)個，sh-CXCR2組少于轉染對照組(P<0.05)。

2.6 兩組細胞FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組細胞中FOXO1A、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較

3 討論

膀胱癌包括肌層浸潤性膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌以及轉移性膀胱癌，3類膀胱癌的治療手段和預后均相差甚遠。早期非肌層浸潤性膀胱癌多采用經尿道膀胱腫瘤切除術后膀胱內灌注化療，而對于肌層浸潤以及轉移性膀胱癌多采用全膀胱切除術聯合化療治療，但其復發率、轉移率較高，預后極差[5]。研究顯示，膀胱癌患者術后復發率高達48%～70%，且將近半數患者術后會發生惡性進展或遠處轉移[6]，給膀胱癌的治療帶來了極大的挑戰。新近研究發現，腫瘤干細胞是導致腫瘤復發和轉移的主要原因[7]。腫瘤干細胞具有很強的自我更新和持續增殖能力，且具有多項分化潛能，在腫瘤細胞增殖、侵襲轉移中起重要作用。腫瘤干細胞的存在是腫瘤無法根治的關鍵因素，闡明腫瘤干細胞致癌的具體機制將為腫瘤治療提供新的策略。有學者發現，膀胱癌中存在膀胱癌干細胞[8]，但其在膀胱癌發病中的作用及機制尚不明確。

CXCR2編碼基因位于2q35，由約350個氨基酸組成，屬于G蛋白偶聯受體。其結構域包含有胞內端與胞外端，N末端位于胞外端，是趨化因子配體結合區；C末端位于胞內端，是將胞外信號活化并繼續向下傳遞的關鍵區域[9]。近年研究發現，CXCR2在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移中具有重要的調節作用。Ignacio等[10]報道，CXCR2可通過調控P21抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖。Cui等[11]報道，CXCR2可通過調控上皮間質轉化促進腫瘤細胞的侵襲轉移能力。Huang等[12]報道，CXCR2可增強腎癌細胞的干樣特性。Wang等[13]認為，CXCR2可能是一個新的干細胞標記物，CXCR2可通過CXCR2-Src-PKL/Vav2-Rac1促進間充質干細胞向內皮細胞遷移[14]，推測CXCR2可能通過調控膀胱癌干細胞的增殖、侵襲、轉移而促進膀胱癌的復發、轉移。本研究采用原代培養技術分離CD44+膀胱癌干細胞，采用Western blotting法檢測發現CXCR2在膀胱癌干細胞中呈高表達。為了進一步研究CXCR2在膀胱癌復發、轉移中的作用，我們將慢病毒轉染試劑polybrene與CXCR2敲減慢病毒轉染至膀胱癌干細胞中，觀察沉默CXCR2基因表達對細胞增殖、侵襲、轉移能力的影響，結果顯示，sh-CXCR2組細胞增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，侵襲、轉移能力明顯減弱。表明CXCR2可以促進膀胱癌干細胞增殖以及侵襲轉移。

最新研究發現，CXCR2可通過調控細胞周期相關蛋白如CDK4、CDK6促進細胞周期進程，通過調控凋亡相關蛋白Bcl-2抑制細胞凋亡[15]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，Bcl-2凋亡信號通路是線粒體途徑引發的細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著關鍵調控作用。細胞凋亡信號經胞質傳遞至線粒體，并通過BH結構域與線粒體膜上的Bcl-2蛋白結合，降低Bcl-2的抗凋亡作用[16]。FOXO1A是叉頭轉錄因子FOX家族的重要一員，參與調控細胞氧化應激、DNA損傷以及細胞凋亡等多種生物學過程。FOXO1A是Bcl-2上游的調節因子，CXCR2可能是通過FOXO1A/Bcl-2通路，調控細胞凋亡進程促進惡性腫瘤的發生與發展。本研究結果顯示，沉默CXCR2基因表達后，sh-CXCR2組FOXO1A、Bcl-2蛋白表達均降低。提示CXCR2可通過調控FOXO1A通路抑制膀胱癌干細胞凋亡，促進其增殖。

MMP-2和MMP-9屬于MMP家族成員，其主要作用是降解細胞外基質。與其他MMP相比，MMP-2催化區含有半胱氨酸嵌入物，在與膠原蛋白以及彈力蛋白結合過程中發揮關鍵作用。MMP-9位于20q11.1～13.1上，其含有一個O-糖基化的膠原蛋白V樣嵌入物，促進MMP-9與血紅素樣區結合。目前研究已經證實，MMP-2以及MMP-9在腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移、腫瘤血管形成以及免疫調節等過程中均起著重要作用。本研究結果顯示，沉默CXCR2基因表達后，sh-CXCR2組MMP-2、MMP-9表達均降低。提示CXCR2可通過調控MMP-2、MMP-9的表達促進細胞侵襲、轉移。

綜上所述，CXCR2在膀胱癌干細胞中呈高表達，沉默其表達可以降低膀胱癌干細胞的增殖、侵襲、轉移能力，促進細胞凋亡，其機制可能是通過作用于凋亡相關蛋白FOXO1A、Bcl-2，調控凋亡通路進而促進腫瘤生長，通過調控侵襲轉移相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達進而調控細胞的侵襲轉移。該研究為治療膀胱癌提供了新的策略，CXCR2可能成為膀胱癌治療的潛在靶點。