miR-142-5p靶向調控TOP2A基因對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響

朱延杰，尤平洪，唐良友，段曉波，張姚，代慶德，呂東

1德陽市人民醫院，四川德陽618000；2四川省人民醫院(東院)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一。2018年的癌癥統計數據顯示，世界范圍內有超過130萬例新發前列腺癌病例和35.9萬例相關死亡病例[1]。盡管在治療效率方面取得了巨大進展，但前列腺癌患者的長期生存情況仍然不佳[2]。分子靶向治療是腫瘤治療的新型手段，在分子水平研究前列腺癌的發病機制有助于尋找對應的靶標，提高前列腺癌的治療效果。已有研究證實，微小RNA(miRNA)在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用[3]。miR-142-5p對人體免疫調節具有重要作用，在乳腺癌、骨肉瘤和胰腺癌等惡性腫瘤中miR-142-5p呈異常表達，參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等惡性生物學行為[4～6]。拓撲異構酶Ⅱα(TOP2A)在多種腫瘤中報道為癌基因，促進腫瘤的惡性進展[7，8]。Wnt/β-catenin信號通路與包括前列腺癌等腫瘤的惡進展密切相關，可作為抗腫瘤治療的靶點[9]。本研究通過驗證miR-142-5p與TOP2A的靶向關系，并觀察miR-142-5p過表達對前列腺癌LNCaP細胞增殖和侵襲能力的影響，分析其潛在的作用機制，旨在獲得miR-142-5p作為治療前列腺癌候選靶點的證據。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選擇2017年1月～2018年6月在德陽市人民醫院行手術切除的前列腺癌患者40例，年齡47～81(58.96±18.42)歲。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過，由患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 前列腺癌組織中miR-142-5p、TOP2A mRNA表達檢測 收集手術切除的前列腺癌組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，反轉錄合成cDNA。以其為擴增模板，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒，采用7500 qPCR儀進行擴增。設計合成miR-142-5p引物上游5′-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3′，下游5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′。U6引物上游5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCA-3′,下游5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。TOP2A引物上游5′-ACCATTGCAGCCTGTAAATGA-3′,下游5′-GGGCGGAGCAAAATATGTTCC-3′。GAPDH引物上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。反應條件：95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、70 ℃ 30 s，共40個循環。檢測各樣品的循環閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法進行計算，以U6為內參計算miR-142-5p相對表達量，GAPDH為內參計算TOP2A mRNA相對表達量。

1.3 miR-142-5p靶向調控TOP2A的驗證 前列腺癌LNCaP細胞復蘇后，重懸至含有10% FBS的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。使用TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-142-5p的靶基因。取生長狀態良好的LNCaP細胞，以4×103/孔接種到96孔板中，分為NC wt、miR-142-5p wt和NC mut、miR-142-5p mut組。接種24 h后采用lipofectamine2000進行質粒轉染，NC wt組轉染TOP2A-wt和NC，miR-142-5p wt轉染TOP2A-wt和miR-142-5p mimic，NC mut轉染TOP2A-mut和NC，miR-142-5p mut組轉染TOP2A-mut+miR-142-5p mimic，6 h后換液。收集轉染48 h的各組細胞，根據雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.4 細胞分組與轉染 取生長狀態良好的LNCaP細胞，按2×105/孔接種至6孔板中，分為正常對照組、轉染對照組和TOP2A過表達組。接種24 h后采用lipofectamine2000進行質粒轉染，正常對照組轉染NC質粒、轉染對照組轉染miR-142-5p mimic、TOP2A過表達組轉染miR-142-5p mimic和TOP2A過表達質粒，6 h換液。轉染48 h后，PBS洗3次，胰酶消化收集細胞斑塊，加入TRIzol試劑提取細胞總RNA，采用qPCR方法檢測正常對照組、轉染對照組和TOP2A過表達組TOP2A表達，評價質粒轉染效果達到實驗所需要求。

1.5 細胞增殖能力觀察 采用MTS實驗。取三組細胞，按2×103/孔接種至96孔板中，分為正常對照組、轉染對照組和TOP2A過表達組，每組設置6個復孔。接種24 h后采用lipofectamine2000進行各組質粒的轉染，6 h換液。轉染48 h時棄掉培養基，加入100 μL培養基和20 μL MTS，設置空白對照孔，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h。采用酶標儀于490 nm處檢測吸光度(OD)值。細胞增殖率=(實驗孔-空白孔)OD值/(對照孔-空白孔)OD值×100%。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Boyden實驗。取三組細胞，PBS沖洗，加入無血清培養基，調整細胞密度為4×105/mL。取100 μL細胞懸液加到侵襲小室上室的Boyden基質膠上，下室加入500 μL含10% FBS培養基。培養12 h后，PBS洗去上室未穿膜的細胞，下室穿膜的細胞經甲醇固定15 min、結晶紫染色10 min，PBS沖洗后干燥，在顯微鏡下拍照，計數穿膜細胞數。

1.7 細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取三組細胞，加入裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。加入上樣緩沖液煮沸變性，SDS-PAGE凝膠上樣后80 V電泳2 h分離目的蛋白，350 mA濕轉2 h將蛋白轉至PVDF膜上，5% BSA室溫孵育1 h，封閉PVDF膜上非特異性蛋白，加入Wnt3a、β-catenin一抗(稀釋比例均為1∶500)和內參一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入兔二抗(稀釋比例為1∶8 000)室溫孵育3 h，洗膜。用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。用Image J軟件進行灰度值分析，以GAPDH為參照，計算Wnt3a、β-catenin目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 前列腺癌組織中miR-142-5p、TOP2A mRNA表達比較 前列腺癌組織中miR-142-5p表達水平為0.72±0.38，癌旁組織為1.00±0.36，前列腺癌組織中miR-142-5p表達下調(t=6.15,P=0.000)。前列腺癌組織中TOP2A mRNA表達水平為1.62±0.58，癌旁組織為1.00±0.31，前列腺癌組織中TOP2A mRNA表達上調(t=3.73,P=0.000)。Pearson相關分析顯示，前列腺癌組織中miR-142-5p與TOP2A mRNA表達呈負相關(r=-0.601，P=0.024)。

2.2 miR-142-5p對TOP2A mRNA的靶向調控作用 TargetScan7.1軟件在線預測顯示，TOP2A基因啟動子區與miR-142-5p具有結合位點，見表1。雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示，與NC wt組相比，miR-142-5p wt組熒光素酶活性降低(P<0.05)；而NC mut組與miR-142-5p mut組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 TOP2A mRNA與miR-142-5p結合位點預測結果

表2 各組細胞中熒光素酶活性比較

注：與NC wt組比較，*P<0.05。

2.3 三組細胞增殖能力比較 正常對照組、轉染對照組和TOP2A過表達組的細胞增殖率分別為100%±1.00%、37.35%±6.35%、54.68%±3.06%。與正常對照組相比，轉染對照組和TOP2A過表達組細胞增殖率降低；與轉染對照組相比，TOP2A過表達組細胞增殖率升高(P均<0.05)。2.4 三組細胞侵襲能力比較 正常對照組、轉染對照組和TOP2A過表達組的穿膜細胞數分別為(78.39±11.65)、(30.12±5.28)、(55.07±8.34)個。與正常對照組相比，轉染對照組和TOP2A過表達組的細胞穿膜數減少；與轉染對照組相比，TOP2A過表達組細胞穿膜數增加(P均<0.05)。

2.5 三組細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達比較 與正常對照組相比，轉染對照組和TOP2A過表達組Wnt3a、β-catenin蛋白表達降低；與轉染對照組相比，TOP2A過表達組Wnt3a、β-catenin蛋白表達增加(P均<0.05)。見表3。

表3 三組Wnt3a、β-catenin蛋白表達比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與轉染對照組相比，#P<0.05。

3 討論

目前前列腺癌的標準療法是手術和放療，但手術或放療者仍有約8.4%的復發率[10]。由于前列腺癌癥狀具有隱匿性，患者確診時多為晚期，雄激素剝奪治療雖然可減輕70%～80%患者的癥狀，但大多數患者將在2年內復發至無法治愈的雄激素非依賴狀態[11]。此外，晚期患者最常發生骨轉移，嚴重影響患者的生存質量和預后。因此研究前列腺癌治療的藥物靶點至關重要。

前列腺癌的發生發展涉及癌基因和抑癌基因的失控及表觀遺傳學的改變。miRNA是內源性單鏈非編碼RNA，長度為19～22個核苷酸，在轉錄后水平調控靶基因的表達。miRNA參與了干細胞發育、自噬、轉化、增殖控制、細胞分化、細胞周期、細胞凋亡等多種細胞生理過程[12]，同時miRNA的異常表達與腫瘤進展密切相關，使其成為腫瘤預后、診斷潛在標志物和治療靶點[3]。miR-142是少數造血系統特異性miRNA之一，以miR-142-3p和miR-142-5p兩種成熟同工型形式存在，miR-142-5p主要表達在胸腺來源的調節性T細胞中[13]。miR-142-5p在腫瘤的發生發展中也發揮重要作用，miR-142-5p在乳腺癌細胞中表達增加，具有促進腫瘤細胞增殖和侵襲的作用[4]。而miR-142-5p在骨肉瘤和胰腺癌中低表達，具有抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用[5，6]。這表明miR-142-5p依據不同的腫瘤類型，既可以發揮致癌又可以發揮抑癌作用。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-UTR區部分互補結合來調節轉錄后的沉默，研究報道miR-142-5p確定的調控靶基因包括PTEN、PLA2G16和RAP1A等[4～6]。本研究采用生物學信息預測軟件和雙熒光素酶報道基因試驗發現TOP2A基因啟動子區與miR-142-5p有結合位點，是miR-142-5p的靶基因。

TOP2A是一種必需的核酶，在轉錄過程中調節DNA的拓撲狀態，并參與染色體濃縮和染色單體分離[14]。研究報道，TOP2A高表達預示著各種人類癌癥的不良預后[7，8]。我們推測，miR-142-5p和TOP2A在前列腺癌的發生發展過程中具有重要作用。本研究結果顯示，前列腺癌組織中miR-142-5p低表達，TOP2A mRNA高表達，二者呈負相關；過表達miR-142-5p能夠抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力。這表明miR-142-5p在前列腺癌中發揮抑癌作用，與其在骨肉瘤[5]和胰腺癌[6]中的作用相同。進一步研究顯示，增加的TOP2A可顯著減弱miR-142-5p對前列腺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用，表明miR-142-5p通過靶向TOP2A抑制前列腺癌的惡性進展。

此外，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤增殖和侵襲密切相關，在前列腺癌中處于激活狀態;Wnt3a和β-catenin是該通路的關鍵蛋白，在前列腺癌中高表達，促進腫瘤惡性進展[9]。本研究結果顯示，miR-142-5p能夠抑制前列腺癌細胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表達，而TOP2A能夠減弱miR-142-5p對前列腺癌細胞中Wnt3a、β-catenin蛋白的抑制作用。表明miR-142-5p靶向TOP2A抑制Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述，前列腺癌組織中miR-142-5p表達降低，TOP2A表達降低增加，二者呈負相關；miR-142-5p靶向調控TOP2A基因抑制前列腺癌的進展，可能通過使Wnt/β-catenin信號通路失活。