全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法檢測白酒生產用水中β-內酰胺類抗生素

宋廷富，廖勤儉，周韓玲，安明哲，李楊華，王 芳，郭 艷，王小琴，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓 644007）

β-內酰胺類抗生素屬于抗生素大家族中的一員，主要包括頭孢菌素類和青霉素類兩大類，其基本結構具有一個四元β-內酰胺環通過N 原子與一個五元或六元環稠合。β-內酰胺類抗生素具有極強的抗菌作用，普遍用于獸醫藥治療，也可以添加到動物飼料中預防牲畜疾病[1]。隨著β-內酰胺類抗生素被大量頻繁的使用，水環境中抗生素含量急劇增加，將會對環境造成很大的危害。為了評估抗生素對釀酒環境的影響，因此建立一種水環境中抗生素高效、快速的檢測方法成為了當下研究的熱點。

由于水中目標分析物含量較低，因此樣品的前處理技術非常關鍵。常用的前處理技術包括固相萃取技術（SPE）[2-3]、固相微萃取技術（SPME）[4]、基質固相萃取技術（MSPD）[5]和免疫親和色譜法（IAC）[6]等。其中固相萃取技術具有便捷、高效且能實現自動化處理的優勢，因此本實驗采用全自動固相萃取系統對水樣進行前處理。該系統能同時處理6 個樣品，自動連續處理60 個樣品，極大地提高了前處理工作效率。

目前檢測β-內酰胺類抗生素的方法有高效液相色譜法（HPLC）[7-8]、液相色譜-串聯質譜（LCMS/MS）[9-12]、高效毛細管電泳（HPCE）[13]、高效薄層色譜法（HPTLC）[14]等。由于LC-MS/MS 技術具有高靈敏度、低檢測限特性，被廣泛應用于抗生素分析。本研究采用全自動固相萃取技術作為前處理技術，結合LC-MS/MS 檢測分析，通過優化前處理過程，建立了釀酒水環境中6 種β-內酰胺類抗生素的分析方法，為高效、快速分析釀酒環境中的抗生素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：生產用水，五糧液股份有限公司提供。

試劑耗材：HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國waters公司）；甲醇（質譜級，美國Merck公司）；檸檬酸（分析純）；Na2EDTA(分析純)；磷酸氫二鈉（分析純）；甲酸(色譜級，美國fisher 公司)；β-內酰胺類抗生素標準品：青霉素V 鉀、頭孢噻肟鈉鹽92 %、頭孢噻呋99 %、鄰氯青霉素鈉99 %、雙氯青霉素·H2O 98%、頭孢匹林（均購于百靈威試劑公司）。

儀器設備：5500 系列三重四級桿質譜儀和Xksper110 系列高效液相色譜儀，美國應用生物系統公司；AutoEVA-60 全自動平行濃縮儀，睿科公司；FotectorPlus-60 全自動固相萃取儀，睿科公司；5810R 冷凍離心機，德國Eppendof 公司；振蕩器，德國IKA 公司；十萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；超純水制備儀，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

精確稱取各β-內酰胺類抗生素標準品，以甲醇溶液配制成50 mL 濃度為1000 mg/L 的混合標準儲備液，放置于-20 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 液相色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A 相為超純水(含0.1 %甲酸），B相為甲醇；流速：0.2 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，90%～2%A；5～9 min，2%A；9～11 min，2%～90%A；11～15 min，90%A。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：5500 V；氣簾氣：30 psi；碰撞氣：8 psi；離子源溫度：550 ℃；加熱氣1:55 psi；加熱氣2:55 psi。6 種β-內酰胺類抗生素的碰撞電壓及其他質譜條件見表1。

表1 β-內酰胺類抗生素的質譜參數

1.2.3 樣品預處理

水樣預處理：取生產用水200 mL，加入EDTAMcIlvaine 緩沖溶液（pH4.0，10 mL，0.1 mol/L）調節水樣的pH4.0，加入硫代硫酸鈉50 mg，加入標準品5 μg/L過柱。

水樣富集與凈化：詳細的固相萃取流程見表2。洗脫的樣品在35 ℃，3.5 psi 條件下氮吹濃縮至近干，用20 %甲醇定容至1.0 mL，過0.22 μm 濾膜待測。

表2 Fotector Plus對水中β-內酰胺類抗生素的固相萃取富集方法

2 結果與分析

2.1 固相萃取條件的優化

2.1.1 固相萃取柱的優化

固相萃取小柱會對最終的加標回收率產生很大的影響，考慮到目標化合物的性質，參考已發表文獻，選取waters 公司的HLB 柱作為固相萃取小柱。對比3種HLB小柱（60 mg/3 mL；200 mg/6 mL；500 mg/6 mL）的回收效果，在250 mL 水樣時，保證加標回收率和節約成本的情況下，60 mg/3 mL 的HLB柱能滿足要求。

2.1.2 固相萃取裝置的選擇及參數優化

水樣的前處理步驟繁瑣耗時，目前主要都是手動固相萃取裝置。為了滿足快速、高效的檢測要求，本實驗采用了全自動固相萃取裝置，該設備能夠同時處理6 個樣品，能夠連續處理60 個以上樣品，特別是對于大體積上樣的水樣來說極大地縮短了前處理時間。經過優化后的洗脫程序見表2，對于200 mL樣品，處理6個樣品只需要100 min。

2.1.3 洗脫液的確定

選擇洗脫液為純甲醇，對比4 mL、6 mL、10 mL洗脫液發現，當體積增加時對回收率的提高不明顯且會延長氮吹的時間，太低又會影響洗脫效率，導致萃取柱有抗生素殘留，本實驗確定了最佳的洗脫體積為6 mL。

2.1.4 pH值對固相萃取結果的影響

水樣的pH 值對最終的回收率影響較大，在酸性環境中回收率較高，那是因為β-內酰胺類抗生素在酸性環境中更加穩定。本實驗比較了甲酸、EDTA-McIlvaine 緩沖溶液來調節水樣的pH 值，發現調節同樣的pH 值的情況下EDTA-McIlvaine 緩沖溶液的回收率更高。可能是因為水中的金屬離子與緩沖液中的EDTA 產生了螯合反應。最終優化了pH值參數，確定了pH4時，回收率最佳。

2.2 色譜-質譜條件優化

2.2.1 色譜條件的優化

本實驗比較了甲醇和乙腈作為流動相的分離效果，最后發現使用甲醇分離更好，質譜信號更強。實驗還比較了5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-甲醇作為流動相，結果表明，加入甲酸銨峰形沒有明顯改善，且后兩種流動相峰型差別不大，最后選擇了0.1%甲酸水-甲醇作為本實驗的流動相。

2.2.2 質譜條件的優化

本實驗對6 種β-內酰胺類抗生素的離子化方式、去簇電壓、碰撞電壓等進行了優化，結果見表1。6種β-內酰胺類抗生素質譜圖見圖1—圖7。

2.3 目標化合物的線性范圍、檢出限與定量限

6種β-內酰胺類抗生素采用外標法定量，配制6種抗生素的混合標準溶液，分別是1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L，以各種抗生素的濃度為橫坐標，以各種抗生素的峰面積為縱坐標，得到線性方程和相關系數。按照S/N=3 計算各種抗生素的檢出限，按照S/N=10 計算各種抗生素的定量限，結果見表3。所有目標化合物的相關系數（R2）均大于0.997，該方法檢出限分別為0.0202～0.2679 μg/L；定量限分別為0.0672～0.8929 μg/L。

2.4 加標回收率及精密度實驗

取生產用水添加5 μg/L 的6 種β-內酰胺類抗生素標準溶液，以3 組平行加標樣品測定各抗生素的回收率及標準偏差，結果見表4。6 種目標化合物的加標回收率為78.4%～93.3%，相對標準偏差為2.31%～9.60%。

2.5 實際樣品的測定

根據以上建立的檢測方法對五糧液股份公司的生產用水中β-內酰胺類抗生素含量進行檢測，檢測結果顯示，濃縮200 倍后的生產用水中并未檢出上述6種抗生素。

表3 6種β-內酰胺類抗生素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

表4 6種β-內酰胺類抗生素生產用水中加標回收率和精密度(n=3)

3 結論

建立了全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法檢測生產用水中6 種β-內酰胺類抗生素的檢測方法，運用該檢測法對五糧液釀酒車間的生產用水進行檢測，均未檢出。實驗表明，該檢測法靈敏度高，穩定性好，可以快速、高效的檢測水中的抗生素。本檢測法能夠為釀酒環境中抗生素的檢測提供參考。