釀造黃酒用糧食原料中嘌呤的檢測(cè)研究

劉 鎮(zhèn) ，周婷婷，王靈芝，相露婷，傅華靖，姜顧倩妮，胡建剛，孟燕青

（1.紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江紹興 312000；2.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州 310052）

嘌呤在食物中廣泛存在，在人體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物是尿酸[1]。研究表明，長(zhǎng)期外源性嘌呤攝入過(guò)多或者尿酸排出減少（障礙）都會(huì)導(dǎo)致人體尿酸過(guò)高。近年來(lái)，高尿酸血癥的發(fā)病也日漸增多，逐漸成為一種大眾罹患的常見(jiàn)病、多發(fā)病。尿酸高被視為與傳統(tǒng)意義上的“三高”（高血壓、高血脂、高血糖）比肩齊名的“第四高”[2-3]。嘌呤的攝入與尿酸高關(guān)系密切，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，黃酒中含有嘌呤類(lèi)物質(zhì)[4]。為探索黃酒中嘌呤來(lái)源，需要對(duì)釀酒原料中嘌呤物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。黃酒的釀造原料主要有粳米、糯米、小麥、黍米、黑米等。我們以粳米為研究對(duì)象，優(yōu)化樣品的水解條件，建立檢測(cè)方法，使用優(yōu)化好的方法對(duì)各類(lèi)糧食中腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：粳米、黑米、糯米、小麥、黍米。

試劑：腺嘌呤（≥99.5 %，阿拉丁）、鳥(niǎo)嘌呤（≥99%，阿拉丁）、黃嘌呤（≥98%，阿拉丁）、次黃嘌呤（≥99 %，阿拉丁）、85 %磷酸（AR）、KH2PO4（AR）、KOH（AR），三氟乙酸（GC）、甲酸（HPLC）、高氯酸（AR）、濃硫酸（AR）。

儀器：高效液相色譜儀（島津，LC-20ADXR），電子天平（梅特勒-托利多，ME204E），氮吹儀（Organomation，N-EVAP-24），酸度計(jì)（梅特勒-托利多，S220）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3（4.6 mm × 150 mm，3 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH4.07）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器（UV）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱(chēng)取腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤標(biāo)樣25 mg，分別用超純水定容至25 mL，配制成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（嘌呤不易溶于水，可加入NaOH 溶液助溶）。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋配制成0.1～20 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。在1.2 色譜條件下進(jìn)行分析，以每種物質(zhì)的峰面積與標(biāo)樣濃度做線性回歸曲線。

1.4 樣品前處理

取0.1 g 預(yù)先磨碎的樣品置于10 mL 玻璃試管中，向其中加入1 mL 水混勻，再加入1 mL 酸液，混勻后置于水浴中反應(yīng)10～60 min，冷卻，氮吹至體積約0.5 mL，加4 mL 水后，用15 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 值至5～7 之間，最終定容至5 mL，過(guò)0.45 μm濾膜待測(cè)，并根據(jù)具體測(cè)定情況（例如結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大、峰形不好以及操作出現(xiàn)失誤等）對(duì)樣品進(jìn)行多次重復(fù)處理測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件的確認(rèn)（圖1）

嘌呤是一種溶于水的極性化合物，可選用反相C18柱對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)[5]。我們?cè)谇捌诠ぷ髦胁捎肸ORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱分析，發(fā)現(xiàn)盡管鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤可以完全分離，但是腺嘌呤容易拖尾。本研究參考文獻(xiàn)方法[6]并做適當(dāng)更改，采用Waters Atlantis T3進(jìn)行分離，組分可實(shí)現(xiàn)完全分離，且峰形好，無(wú)拖尾。流動(dòng)相pH 值對(duì)4 種嘌呤分離影響顯著，考察了相同濃度（0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液），不同pH 值（3.64、3.87、4.07）下流動(dòng)相對(duì)4 種嘌呤分離及峰形的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)流動(dòng)相pH 值為3.64 和3.87 時(shí)，4 種嘌呤組分不能完全分離。進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相pH 值進(jìn)行優(yōu)化，最終將pH 值調(diào)至為4.07 時(shí)，4 種嘌呤組分實(shí)現(xiàn)完全分離。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

在1.2 方法條件下，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入液相色譜儀進(jìn)行分離測(cè)定，以峰面積與標(biāo)樣濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。在0.1～20 mg/L 濃度范圍內(nèi)，4 種嘌呤的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R大于0.9999。

表1 4種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品水解條件的確定

糧谷中嘌呤物質(zhì)一般需先通過(guò)水解成游離堿基形式再進(jìn)行檢測(cè)。常見(jiàn)的水解用酸有高氯酸、硫酸、三氟乙酸∶甲酸等[6-8]。本研究分別對(duì)以上3 種酸水解法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3 種方法都可以水解出糧谷中的嘌呤。高氯酸水解法在水解結(jié)束后調(diào)節(jié)樣液pH 值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，需要進(jìn)行過(guò)濾、洗滌沉淀，操作繁瑣，且易造成目標(biāo)產(chǎn)物損失；硫酸水解法在調(diào)節(jié)pH 值步驟時(shí)產(chǎn)生少量沉淀，過(guò)濾后樣液中硫酸鹽含量較高，在15 ℃進(jìn)樣盤(pán)中因溫度降低容易產(chǎn)生新沉淀，不利于分析；采用三氟乙酸∶甲酸（體積比1∶1）水解后，可以利用三氟乙酸和甲酸易揮發(fā)的特性，氮吹除去大部分酸，降低樣液中鹽濃度，調(diào)節(jié)pH 值過(guò)程中樣液始終澄清透明，無(wú)沉淀產(chǎn)生。因此選用三氟乙酸∶甲酸（體積比1∶1）水解法。

對(duì)水解時(shí)間和水解溫度進(jìn)行優(yōu)化，在40 ℃、60 ℃、80 ℃、沸水浴下分別水解10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min。結(jié)果顯示，水解30 min 時(shí)，嘌呤含量達(dá)到峰值。在30 min 之后，嘌呤含量略有降低。沸水浴下水解產(chǎn)物中嘌呤含量高于其他溫度下水解的嘌呤含量，因此選擇沸水浴水解30 min為最優(yōu)水解條件。

2.4 精密度、回收率和檢出限

采用粳米作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)。取已知嘌呤含量的粳米樣品18 份，每份約0.1 g，向樣品中加入3 個(gè)不同濃度水平的4 種嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做6 次平行，按照2.3 處優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行前處理。根據(jù)4 種嘌呤的加標(biāo)量和測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。各組分加標(biāo)平均回收率在84.8 %～102.1 %，RSD 在2.4 %～9.8 %，均符合分析測(cè)定的要求。以信噪比3∶1 確定檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 糧食中4種嘌呤的測(cè)定結(jié)果

表2 加標(biāo)回收率、精密度、檢出限

表3 釀造黃酒用糧食原料中嘌呤含量 (mg/kg)

對(duì)5 種常見(jiàn)的釀造黃酒用糧食原料進(jìn)行測(cè)定，采用三氟乙酸∶甲酸（體積比1∶1）在沸水浴下水解30 min，高效液相色譜法分析樣液，嘌呤含量見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，小麥的嘌呤含量最高，黍米的嘌呤含量最低。水解產(chǎn)物的鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤含量普遍高于黃嘌呤和次黃嘌呤，粳米和黑米樣品中沒(méi)有檢測(cè)到黃嘌呤和次黃嘌呤。其原因可能是粳米和黑米的黃嘌呤和次黃嘌呤含量低于檢出限。

3 結(jié)論

本研究建立了一種釀造黃酒用糧食原料中嘌呤含量的多組分高效液相色譜分析方法。以三氟乙酸∶甲酸（1∶1）在沸水浴中水解樣品30 min，采用Waters Atlantis T3柱，用高效液相色譜法對(duì)樣液進(jìn)行定量定性分析。結(jié)果顯示，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，各組分加標(biāo)平均回收率在84.8%～102.1%，RSD 在2.4%～9.8%，均符合分析測(cè)定要求，可用于釀造黃酒用糧食原料中嘌呤的檢測(cè)。