利用Mintab軟件優化燃料乙醇生產發酵條件

陳凡榮，佟 毅，劉海濱，梁春慧

（1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江肇東 151100；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033）

近年來，隨著世界性的能源危機日益嚴重，我國霧霾等環境問題也愈趨嚴重。燃料乙醇是一種可再生燃料，與石油功能相似[1]；目前，10 多個國家和地區已在使用燃料乙醇，使用最多的是美國、巴西、歐盟和中國。一代乙醇是以玉米等淀粉質為原料發酵制得的可再生能源，已經在能源領域脫穎而出，并越來越顯示出廣闊和深遠的發展前景[5]。

2017 年9 月，國家發改委、國家能源局、財務部等十五部委出臺的《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》規定，2020 年基本實現全覆蓋推廣使用乙醇汽油，對發展我國燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油具有重大意義。按照規劃要求，2020年我國所有車用汽油均改為乙醇汽油，當前我國車用汽油表觀消費量為1.23億噸，2020 年我國汽油消費量將達到1.2 億噸，按10%組分計算，燃料乙醇消費量為1500萬噸，是當前消費量的5倍，市場空間巨大。

隨著政策的深化實施與技術的進步，中國燃料乙醇工業將迎來激增現象，在保證生產成本的前提下，優化發酵條件，精細化控制，提高原料利用率，是提高企業競爭力的有效手段之一[14]。本試驗以燃料乙醇企業現有的工藝情況為基礎，利用Minitab17 軟件優化燃料乙醇生產的發酵條件，以期實現生產效率的提高。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

試驗材料：31%干物液化醪，從燃料乙醇企業生產現場取回；高效糖化酶，酶活力360000 U/mL；市售酸性蛋白酶，酶活力100000 U/mL。

試劑：市售尿素。

1.2 儀器與設備

1260 液相色譜，安捷倫科技發展有限公司；3-18 k 離心機，Sigma 公司；AL20 分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FiveEasyPlus pH 計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；ZHWY-2112F 搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 檢測方法

試驗組成熟醪的測定：采用高效液相色譜法。

色譜檢測條件：流動相：0.005 mol/L H2SO4；預處理柱：伯樂125-0129，30 mm×4.6 mm；色譜柱：伯樂HPX-87H，300 mm×7.8 mm；泵流：0.8 mL/min；柱溫：65 ℃；RID 檢測器溫度：50 ℃；進樣量15 μL；運行時間30 min[2]。

2 結果與分析

2.1 發酵條件因素的優化

糖化酶作用于淀粉分子中結合的1，4-糖苷鍵，從分子長鏈的非還原端，一個一個地水解為葡萄糖分子，水解后的產物幾乎全部生成萄萄糖[4]。發酵前期糖化酶加量過高，水解產生的葡萄糖含量大，會對酵母產生一定的抑制作用[15]，導致發酵酒精度偏低；糖化酶加量過低時不能將糊精類物質完全分解，發酵最終酒精度偏低，殘糖含量高[6]。

在酒精發酵過程中，酵母細胞中含氮量雖然不高，只占到2 %左右[9-10]，但是它的作用卻非常重要。在發酵過程中添加尿素可為酵母的生長和代謝提供所需的游離氨基氮。大量的研究表明，當游離氨基氮的濃度大于100 mg/L時，酵母菌的繁殖呈直線增長，而超過870 mg/L 時，再增加含氮量也不會對其有明顯的影響。因此氮濃度在150～870 mg/L的范圍，會直接影響到發酵的速度[12]。

酵母生長的最適pH4.5～5.0；但在此條件下也適宜其他雜菌的生長，當pH 值降到4.2 以下時，酵母仍能繼續繁殖，但此時，乳酸菌已停止生長。所以在生產過程中一般將發酵初始pH 值控制在4.0～4.5之間。

酸性蛋白酶是具催化功能的酶，能夠水解蛋白質，在酸性條件下具有較高的活性，能水解原料中的縮氨酸鍵，釋放氨基酸[11]。酵母在發酵階段的生長可以通過懸浮蛋白質轉化的氨基酸來促進，從而加速發酵并提高產量。酸性蛋白酶加量過低時，不能將原料中的蛋白質分解以供酵母利用，導致發酵結束酒精度較低；在氮源充足的情況下，原料中蛋白質含量是固定的，酸性蛋白酶加量過高對酒精度的影響作用差異不大[13]。

由于試驗因素較多，對所有因子進行交互試驗需耗費大量時間和精力，采用Mintab軟件輔助設計全因子試驗[3]，結合前期試驗條件的影響，擬定試驗因子為糖化酶加量(最大值1.2 kg/t醪、最小值0.8 kg/t醪)，尿素(最大值4.0 kg/t 醪/、最小值2.5 kg/t 醪)，酸性蛋白酶加量(最大值0.3 kg/t 醪、最小值0.2 kg/t醪)，pH(最大值4.5、最小值4.0)具體設計如表1所示。

表1 實驗設計各因素與水平 (kg/t醪)

2.2 實驗結果與分析

每個試驗組重復兩次實驗，在發酵結束測定酒精度。具體實驗數據見表2。

通過軟件計算，得出模型及回歸方程，其R-sq=91.04%、R-sq（調整）=86.78%，說明刪去所有影響不顯著項后的模型結構較好，回歸方程具有較好的預測能力。以未編碼單位表示的回歸方程酒精度（%vol)=15.6159+0.04094 糖化酶+0.04406 尿素+0.03469 酸性蛋白酶-0.00094 pH+0.02781 糖化酶*尿素+0.01219 糖化酶*酸性蛋白酶+0.00781 糖化酶*pH+0.01531 尿素*酸性蛋白酶+0.01969 尿素*pH+0.00156 酸性蛋白酶*pH（圖1）。方程的擬合是使用已編碼單位進行的，多項式模型方程擬合的性質由確定系數R2表示，R2=0.9125，說明此模型近似的擬合于真實情況，預測值和實測值之間具有高度的相關性，可以解釋91.25%實驗所得的響應值的變化。

表2 Plaekett-Burman實驗設計表及結果

通過效應Pareto 可以看出，試驗的關鍵因子為B、A、C、AB、BD、BC、AC、AD、CD、D，即尿素、糖化酶、酸性蛋白酶、糖化酶×尿素、尿素×酸性蛋白酶、尿素×酸性蛋白酶、糖化酶×酸性蛋白酶、糖化酶×pH值、酸性蛋白酶×pH值、pH值（圖1）。

由圖1 可以看出，尿素斜率較大，說明其對發酵的影響顯著，其次為糖化酶、酸性蛋白酶，pH 值的斜率較為平緩，說明其對發酵的影響較不顯著。因子的重要順序為B＞A＞C＞D（尿素＞糖化酶＞酸性蛋白酶＞pH值）。（圖2）

由圖2 可以看出，糖化酶與pH 值、尿素與pH值之間存在著一定的交互作用，糖化酶與尿素、糖化酶與酸性蛋白酶、尿素與酸性蛋白酶不存在明顯的交互作用關系。（圖3）。

通過相應優化器，利用控制方程式對數據進行計算[7-8]，得出最佳操作水平為糖化酶1.2 kg/t 醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5。采用最佳操作水平數據進行試驗，以驗證發酵結果，通過試驗發現，發酵72 h 時，發酵酒精度為15.82%vol，優于其他試驗組。如圖4所示。

3 結論與展望

使用燃料乙醇企業生產線上的31%干物液化醪進行發酵試驗，經過具體實驗，糖化酶1.2 kg/t醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5，發酵效果最優，酒精度可達15.82 %vol，乙醇得率提高2%。由于研究方向以及設備儀器的原因，本次實驗主要對發酵成熟酒精度進行了比較，并未對發酵后的殘總糖、殘淀粉等項目進行檢測，后續研究將對配料物料粒度分布、液化和發酵參數控制進行綜合研究，從而確定更優的燃料乙醇的生產工藝條件，促進酒精發酵的高效發展與進步。