一株拮抗放線菌的鑒定及其對香蕉枯萎病的生防效應

賴寶春 戴瑞卿 林明輝 吳振強 王家瑞

摘要：【目的】鑒定一株從健康辣椒根際土壤中分離獲得的菌株（編號FX81），研究其防治植物病害和促進植物生長的潛能，為開發具有實用價值的香蕉枯萎病生防制劑及生物有機肥提供材料。【方法】采用平皿對峙法和菌絲生長速率法測定菌株FX81發酵液對13種病原真菌的抑菌活性及抑菌譜;將菌株FX81制成生物有機肥，利用菌劑根部穴施，評價其對香蕉植株的促生效果及對香蕉枯萎病的防治作用。通過形態學、生理生化特征及16S rDNA序列分析確定菌株FX81的分類地位。【結果】平皿對峙試驗結果顯示，菌株FX81對13種供試病原真菌均具有較好的拮抗作用，其中對香蕉枯萎病菌的抑制作用最強，抑菌帶寬為13.1 mm;生長速率法測定結果顯示，菌株FX81對香蕉枯萎病菌的抑制率為81.7%，對其他病原菌的抑制率為62.7%～80.8%，表明菌株FX81的抑菌譜較廣。盆栽試驗結果表明，施用生防菌劑FX81對香蕉有一定的促生作用，對香蕉枯萎病的防治效果達81.05%。綜合菌株FX81的生理生化特征、培養特征及16S rDNA序列分析，鑒定菌株FX81為灰銹赤鏈霉菌（Streptomyces griseorubiginosus）。【結論】灰銹赤鏈霉菌FX81對香蕉枯萎病具有較好的防治效果，且對香蕉植株具有促生作用，在防治植物土傳病害方面具有良好的開發前景。

關鍵詞： 拮抗放線菌;灰銹赤鏈霉菌;分類鑒定;生防作用;香蕉枯萎病

Abstract：【Objective】A strain coded as FX81 from rhizosphere of healthy chilli plant was isolated and identified，its potential for controlling plant disease and promoting plant growth was analyzed to provide referencefor developing a biocotrol agent for banana fusarium wilt disease in banana and bio-organic fertilizers. 【Method】Flat-stand method and hyphal growth rate method were used to determine antibacterial activity and antimicrobial spectrum of strain FX81 fermentation liquid against 13 phytopathogens. A biofertilizer that contained strain? FX81 was developed and applied to plant root and used to investigate the effects of strain FX81 on promoting growth of banana and controlling fusarium wilt in banana. Morphological， physiological and biochemistry characteristics and 16S rDNA sequence were used to identify the taxonomic status of strain FX81. 【Result】Results of flat-stand showed that the strain FX81 showed antibacterial effects on 13 plant pathogens. In addition， the antibacterial activity for against Fusarium oxysporum f.sp cubensewas the highest of all， the width of antibacterial band was 13.1 mm. Results of hyphal growth showed that the inhibition rate of strain FX81 to F. oxysporum was 81.7%， however the inhibition rate to the rest of pathogen was 62.7%-80.8%. It meaned that strain FX81 had broad antibiotic spectrum. The results of potted test showed that the mixture of the strain and organic fertilizer promoted the growth of banana， and the controlling efficiency on banana fusarium wilt was 81.05%. According to the results of morphological， physiological and biochemistry characteristics and 16S rDNA sequence， strain FX81 was identified as Streptomyces griseorubiginosus. 【Conclusion】S. griseorubiginosus FX81 is effective in biocontrolling wilt in banana caused by F. oxysporum and has growth promoting effects on banana plants. The findings demonstrate that the strain has potential value for soil-borne diseases controlling and preventing in the field.

0 引言

【研究意義】香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起的毀滅性土傳真菌病害（張志紅等，2011）。目前世界上尚無防治香蕉枯萎病的特效藥，生產上針對該病主要以種植抗病品種與施用藥劑相結合，但種植的抗病品種存在抗病性狀之外的其他經濟性狀丟失現象，如產量低、植株過高，香蕉果品味較差而無實際利用價值;大量使用化學藥劑防治效果也不理想，易造成環境污染和生態失衡。因此，采用綜合措施防控香蕉枯萎病尤為重要，利用活體微生物或其代謝產物防治香蕉枯萎病符合生態保護的發展趨勢，但目前未見田間大面積試驗并能成功防治香蕉枯萎病的實例，仍需篩選更多的生防菌并應用于生產實踐。【前人研究進展】近年來，國內外學者在香蕉枯萎病生物防治方面開展了大量工作。Shen等（2015）研究發現，施用含解淀粉芽孢桿菌的有機肥能改變根際土壤微生物區系結構，顯著提高土壤中細菌的多樣性和降低尖孢鐮刀菌的豐度，刺激產生大量的有益微生物，從而抑制香蕉枯萎病發生。王國芬等（2016）篩選到3株芽孢桿菌D7-16、A5-6和CL7，對香蕉枯萎病的防效分別為72.3%、45.4%和50.0%。張琳等（2016）研究了枯草芽孢桿菌TR21對粉雜1號香蕉枯萎病的防控效果，結果表明，TR21能降低粉雜1號香蕉枯萎病的發病率，增加單株產量，且能縮短粉雜1號的生育期。Wang等（2016）報道一株海洋解淀粉芽孢桿菌W19可產生促進植物生長的激素，在溫室及大田條件下可促進香蕉生長，降低香蕉枯萎病的發病率。Fu等（2017）研究接種解淀粉芽孢桿菌有機肥與普通有機肥對患香蕉枯萎病植株根際土壤微生物的影響，結果表明，施用生物有機肥能顯著增加根際土壤細菌的豐度，降低尖孢鐮刀菌的豐度。田丹丹等（2018）從香蕉植株根部分離獲得一株解淀粉芽孢桿菌GKT04，該菌對香蕉枯萎病菌的生長抑制率為33.33%，能降低香蕉枯萎病菌孢子萌發率，菌液灌根處理香蕉幼苗的枯萎病病情指數比對照降低49.23%。Khan等（2018）研究枯草芽孢桿菌30VD-1對香蕉枯萎病菌的抑菌機制，發現受抑制的香蕉枯萎病菌菌絲變形、腫脹，認為其幾丁質酶、揮發物和其他抗真菌物質對枯萎病菌起到抑制作用。蘇琴等（2019）篩選到一株綠頭枝孢菌LS1，該菌對香蕉枯萎病具有明顯的促生作用，盆栽試驗結果表明LS1對香蕉枯萎病的防效為63.19%。徐志周等（2019）優化了一株對香蕉枯萎病具有較好抑制作用的伯克霍爾德菌，其抑菌率由優化前的9.18%提高至優化后的34.6%。葉乃瑋等（2019）將3株木霉制成單劑或組合可濕性粉劑進行田間試驗，兩年的試驗結果表明，組合木霉可濕性粉劑對香蕉枯萎病的防治效果分別為85.47%和89.73%。【本研究切入點】已報道拮抗香蕉枯萎病的生防菌株研究多集中在實驗室抑菌階段，盆栽試驗試驗設計中處理的病原菌以孢子液灌根或浸根為主，與田間自然發病的致病土存在較大差異，且施用拮抗菌劑以單劑為主，加之土壤環境因子復雜，導致盆栽防效較好的菌株在田間試驗階段防效并不理想。目前，將優良菌株制成生物有機肥，采用生物菌劑穴施及取田間致病土的方法進行香蕉枯萎病防治的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】以從福建省漳州市健康辣椒根際土壤中分離獲得的一株對香蕉枯萎病菌有較強拮抗作用的菌株（編號FX81）為材料，病土取田間連作致病土，將拮抗菌制成生物有機肥，連續兩年采用菌劑穴施根際的方法進行盆栽試驗，評價菌株FX81對香蕉的促生作用及對枯萎病的防治效果，為開發具有實用價值的枯萎病生防制劑及生物有機肥提供材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

拮抗菌株來源：分離自福建省漳州市平和縣健康辣椒根際土壤（前茬作物為香蕉），編號FX81，保藏于福建省漳州市農業科學研究所。病原菌來源：香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense，Foc4）、蜜柚黑點病菌（Diaporthe citri）、西紅柿枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）、草莓根腐病菌（F.oxysporum）、蜜柚炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、苦瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. momordicae）、蜜柚黑斑病菌（Phyllosticta citriasiana）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. vasinfectum）和黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucurmerinum）由漳州市農業科學研究所分離，并經致病性測定、鑒定及保存;西紅柿葉霉病菌（Fulvia fulva）、榕樹炭疽病菌（C. gloeosporioides）、多肉黑斑病菌（Alternaria alternata）和蘭花莖腐病菌（F. oxysporum）由福建省農業科學院植物保護研究所饋贈。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株FX81發酵液制備及其抑菌譜測定 將100 mL高氏一號液體培養基加入250 mL的三角瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后接入4 mm的菌餅5塊，150 r/min、28 ℃下振蕩培養7 d，得到的發酵液經8000 r/ min離心30 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存備用。采用平皿對峙法（方羽生等，2001）和菌絲生長速率法（方中達，1998）對菌株FX81進行抑菌譜測定。

1. 2. 2 生防制劑制備 將優化好的豬糞與麥麩以質量比4∶6混勻裝入250 mL三角瓶中，每瓶加發酵原料總量20 g，控制料水比為1∶0.8，調節pH 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min，即為固體發酵基質。按15%接種量接入菌株FX81發酵液，28 ℃培養，每天用無菌玻棒翻動2次，培養7 d，待瓶壁及固體培養基中長滿菌絲，并散發出典型的“土腥味”，即完成固體菌劑發酵。

1. 2. 3 菌株FX81防治香蕉枯萎病盆栽試驗

1. 2. 3. 1 供試香蕉組培苗 由漳州市農業科學研究所組培研究室提供，品種為威廉斯，待苗長至4～5片葉、株高13～15 cm時移栽到花盆（直徑35 cm）中。

1. 2. 3. 2 試驗設計 從漳州市南靖縣連續20年種植香蕉且香蕉枯萎病發病率在75%以上的香蕉園取病土，試驗前計數病土中尖孢鐮刀菌的數量為2.1×104 CFU/g。試驗設4個處理，處理1：病土+FX81固體發酵菌劑（20 g）;處理2：病土+固體發酵基質（20 g）;處理3：病土+與固體發酵基質營養成分相當的N、P、K化學肥料;對照：只用病土。試驗結束后取香蕉根際土壤計數尖孢鐮刀菌數量。采用稀釋平板法計數（林先貴，2010），培養基采用Komada選擇培養基（張紹升等，2011）。

固體發酵基質由豬糞與麥麩按質量比為4∶6制成，豬糞含0.50% N、0.60% P2O5、0.45% K2O及有機質18.25%;麥麩含2.10% N、2.52% P2O5、1.55% K2O及有機質40.20%。添加與2%固體發酵基質營養成分相當的N、P、K化學肥料于對照中作為處理3。每盆裝致病土10 kg，每處理15盆，3次重復，每盆種植一株香蕉苗。待香蕉苗生長30 d，連根拔起計算生物量，評價促生效果。當對照香蕉植株發病嚴重時，剖開球莖，計算病情指數，評價抗病效果。試驗重復2次，分別于2017年4月20日—7月10日和2018年4月15日—7月5日在福建省漳州市農業科學研究所試驗大棚進行，正常管理。香蕉枯萎病內部癥狀病級分級標準（謝子四等，2009）：1級，球莖不變色;2級，球莖不變色，但根與球莖交接處變色;3級，球莖變色面積占球莖的0～5%;4級，球莖變色面積占球莖的5%～20%;5級，球莖變色面積占球莖的20%～50%;6級，球莖變色面積占球莖的50%以上;7級，全部球莖變色、壞死;8級，植株枯死。統計病情指數和防治效果。

1. 2. 4 菌株FX81鑒定 形態特征觀察：采用插片法，待菌絲長上蓋玻片后，取菌絲生長適中的蓋玻片置于光學顯微鏡（BPH-600Z，上海炳宇光學廠）下，觀察菌株FX81的氣生菌絲、基內菌絲、孢子絲和孢子的形態特征（方中達，1998）。

培養特征和生理生化特征：參照關統偉等（2015）的方法，進行菌株FX81的碳氮源利用、牛奶凝固、牛奶胨化、黑色素產生、纖維素分解、硝酸鹽還原、明膠液化、色氨酸分解及硫化氫產生等生理生化特征鑒定。培養特征測定所用8種培養基見表4。

分子生物學鑒定：采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，按照使用說明提取其基因組DNA，置于 -20 ℃冰箱保存備用。細菌通用引物參考宋利沙等（2018），27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系25.0 μL：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL（100 ng/μL），10 μmol/L上、下游引物各1.0? μL，加ddH2O補足至25.0 μL;模板DNA用ddH2O代替作為陰性對照。擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。將擴增產物上樣于含有GelRed染料的1%瓊脂糖凝膠中電泳后回收目的條帶，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測定的基因序列登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST比對，并從GenBank數據庫獲得相關分離物的16S rDNA序列，使用MEGA 5.0的Neighbor-joining法構建系統發育進化樹（王涵琦等，2014）。

2 結果與分析

2. 1 菌株FX81的抑菌譜測定結果

平皿對峙試驗結果（表1）表明，菌株FX81對13種供試病原真菌均具有較好的拮抗作用，其中對香蕉枯萎病菌的抑菌帶寬為13.1 mm，與其他病原菌的抑菌帶寬差異極顯著（P<0.01，下同），且隨著培養時間的延長，菌絲出現退化現象（圖1）;對蜜柚黑斑病菌等6種病原菌的抑菌帶寬度為12.1～12.7 mm;對蘭花莖腐病菌等5種病原菌的抑菌帶寬度為11.2～11.8 mm。生長速率法測定結果顯示，菌株FX81對香蕉枯萎病菌的抑制率為81.7%，對其他病原菌的抑制率為62.7%～80.8%，且多次驗證其抑菌效果穩定，說明菌株FX81的抑菌譜較廣。

2. 2 菌株FX81對香蕉的促生及防病作用

2. 2. 1 菌株FX81對香蕉的促生效果 香蕉苗移栽30 d后，連根拔起5～6株健康香蕉植株進行生物量測定。結果（表2）顯示，處理1、處理2和處理3對香蕉植株鮮重和株高均有促生效果，生防菌劑處理1的植株鮮重和株高均高于普通有機肥處理2和化學肥料處理3，三者對香蕉植株的促生效果表現為處理1>處理2>處理3，三者間對香蕉植株的促生效果差異極顯著，且均與對照達極顯著差異水平;其中，處理1、處理2和處理3的香蕉植株鮮重較對照分別提高50.35%、33.04%和15.19%，株高較對照分別提高80.56%、48.14%和24.08%。

2. 2. 2 菌株FX81對香蕉枯萎病的生防效果 試驗觀察發現，香蕉苗移栽25 d后，只用病土的對照植株最先發病，發病部位從下部零星葉片開始黃化，逐漸向上部葉片擴展，后期整株黃化萎蔫，剖開球莖呈褐色腐爛，其次是處理3的植株發病，處理2和處理1最后發病，記錄并觀察至60 d，至對照植株發病嚴重時結束防效試驗。

發病后第60 d統計4個處理香蕉的發病率、死亡率、病情指數和防治效果。結果（表3）顯示，對照、處理3、處理2和處理1香蕉植株的病情指數分別為80.44、77.50、55.53和15.25，發病率和死亡率均逐漸降低，以處理1的防治效果最好，為81.05%，其次為處理2（30.92%），各處理間防治效果差異極顯著。從表3結果可看出，施用生防菌劑FX81能顯著降低香蕉枯萎病的發病率。

2. 2. 3 香蕉盆栽土壤中尖孢鐮刀菌數量動態 尖孢鐮刀菌在土壤中的數量與香蕉枯萎病的發生及嚴重程度密切相關。盆栽試驗結束后，取各處理土壤測定尖孢鐮刀菌數量，試驗前計數致病土中尖孢鐮刀菌的數量為2.1×104 CFU/g，試驗后對照處理根際土壤尖孢鐮刀菌的數量增加至3.8×105 CFU/g ，普通有機肥處理（處理2）和生防菌劑處理（處理1）的根際土壤尖孢鐮刀菌數量變化不明顯，分別為7.6×104和1.3×104 CFU/g，說明施用有機肥和生防菌劑均可減少根際土壤中病原菌的數量。

2. 3 菌株FX81的分類鑒定結果

2. 3. 1 菌株FX81的形態特征 在高氏一號培養基上，菌株FX81生長茂盛，菌落光滑、類圓形，中心凸起，淺黃色，培養至第3 d孢子絲開始從菌落邊緣長出，初為白色，并逐漸轉為灰白色。在顯微鏡下觀察，氣生菌絲和孢子絲均生長豐茂，高度分枝;無橫隔，不斷裂，孢子絲直或曲線形（圖2-A，圖中箭頭為直線型分枝的孢子絲，時常不規則），孢子絲分化形成橢圓形的分生孢子（圖2-B），分生孢子大小為0.70～0.85 ?m×0.90～1.05 ?m。

2. 3. 2 菌株FX81的生理生化特征及培養特性 在8種測試培養基上，菌株FX81培養1～2 d后形成菌落，培養3～4 d后產生孢子。菌株FX81在各培養基上的生長情況、基內菌絲顏色、孢子堆顏色、產生的色素均有差別，在大多數培養基上，菌株FX81能產生可溶性色素，氣生菌絲由白色變為淡粉色或粉紅白色，基內菌絲為黃粉紅色至黃棕色（表4）。菌株FX81的生理生化特征如表5所示。根據形態特征、培養特性及生理生化特征初步鑒定菌株FX81屬于鏈霉菌屬。

2. 3. 3 菌株FX81的16S rDNA序列分析結果 從菌株FX81中PCR擴增得到1條約1472 bp的條帶。將16S rDNA序列提交至GenBank數據庫，選取同源性較高的模式菌株，用MEGA 5.0構建系統發育進化樹（圖3），發現菌株FX81的16S rDNA序列與灰銹赤鏈霉菌[Streptomyces griseorubiginosus（NBRC 13047）]的遺傳距離最近，相似性達100%。綜合上述特征，將菌株FX81鑒定為灰銹赤鏈霉菌。

3 討論

生物防治具有無毒、無殘留及可利用資源豐富等優點，是植物病害防治的發展趨勢。在農業生產上用于防治植物病害的抗生素大多由鏈霉菌屬產生（張健等，2018;李曉春等，2019）。已有文獻報道，灰銹赤鏈霉菌能產多種抗生素及抗真菌純化合物（Amano et al.，2010;Smaoui et al.，2012）;此外，灰銹赤鏈霉菌是拮抗植物根腐病菌的重要生防資源（何冬梅等，2016）。本研究結果表明，放線菌菌株FX81對香蕉枯萎病菌具有較強的抑制作用，該菌株最終鑒定為灰銹赤鏈霉菌，對供試的土傳病害病原真菌均有較強的拮抗活性，但其是否可作為農用抗生素的新來源還需進一步探究。

針對香蕉枯萎病的生物防治，大多數學者主要集中于拮抗菌篩選及其對香蕉枯萎病菌的抑菌機理和單一菌劑防治效果研究。由于土壤環境因素復雜，單獨使用單一的生防菌普遍存在防治效率低、效果不穩定等問題。將優良拮抗菌添加到有機肥中制成生物有機菌肥施于田間，是目前效果較顯著的一種防控方法。張志紅等（2010）通過盆栽試驗比較堆肥、生物有機肥和生物復混肥對粉蕉的促生和防病效果，結果表明生物有機肥效果最佳，能促進粉蕉生長，其防病效果為61.5%。桂莎等（2019）研究發現，盆栽香蕉施用復合真菌制劑可顯著降低香蕉枯萎病的病情指數，增加細菌和真菌群落的豐度和多樣性，顯著減少病原菌的數量，增強植株的抗病能力。周潔瓊等（2019）利用生物菌肥進行大田試驗，結果表明菌肥能使香蕉植株健壯，且能降低病情指數。本研究的拮抗放線菌FX81可直接抑制香蕉枯萎病菌及其他土傳病菌的生長蔓延，將其制作成生物有機肥不僅能促進香蕉植株生長，還能降低土壤中尖孢鐮刀菌的數量，且盆栽試驗病土為本地多年連作的致病香蕉園土壤，更接近生產實際。試驗方法采用香蕉苗根際穴施生物有機肥，有利于拮抗菌聚集于香蕉根際周圍繁殖，更好保護香蕉根系免受病原菌的侵染，連續兩年試驗的防治效果均在80.00%以上，說明FX81生物有機肥對香蕉枯萎病的防治效果穩定。下一步將對FX81生物有機肥進行田間驗證，對其在有機肥中的保質期及香蕉不同生長時期的施用進行深入研究。至今未見利用灰銹赤鏈霉菌對植物病害進行生物防治的研究報道，但已報道的灰銹赤鏈霉菌能產生多種抗菌物質。本研究發現拮抗放線菌FX81與有機物質制成復合微生物有機肥，既具有促進香蕉植株生長及防病的作用，還可調節土壤微生物群落結構，減少病原菌數量，創造有利于植株生長的生態環境。因此，該菌株作為生物有機肥的材料具有良好的開發潛力。

4 結論

菌株FX81對香蕉枯萎病菌具有較強的抑制作用，經鑒定為灰銹赤鏈霉菌（S. griseorubiginosus），將其制成生物有機肥對香蕉枯萎病的防治效果達81.05%，且對香蕉植株具有促生作用，表明該菌株在防治植物土傳病害方面具有良好的開發前景。

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（責任編輯 麻小燕）