云南黃毛草莓的nrDNAITS和cpDNApsbA-trnH序列分子鑒定及進化特征分析

楊俊譽 魏世杰 蘇代發 陳杉艷 羅志偉 沈雪梅 ArslanJamil 童江云 崔曉龍

摘要：【目的】利用核糖體DNA（nrDNA）ITS序列和葉綠體DNA（cpDNA）psbA-trnH序列對云南不同地理區域的黃毛草莓進行分子鑒定，并分析不同地理居群間的分子進化及地理分布特征，為黃毛草莓種質鑒定、保護及開發利用提供理論依據。【方法】以云南省12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品為材料，PCR擴增其ITS和psbA-trnH序列，并進行雙向測序及序列合并，分別基于ITS和psbA-trnH序列及二者合并序列構建系統發育進化樹。最后利用DnaSP 5.10對ITS和psbA-trnH序列進行核苷酸多樣性（π）及單倍型數目、類型和多樣性（Hd）分析，并對黃毛草莓居群進行中性檢驗及分子進化特征分析。【結果】基于ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結果均顯示，12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品均與GenBank數據庫中下載的黃毛草莓聚在一個分支上，分支自展值均大于閾值（75%），表明這兩種序列均可用于黃毛草莓種質的分子鑒定。基于二者合并序列的聚類分析結果與上述結果基本一致，但分支自展值達99%，表明該聚類分析結果更可靠。不同地理區域的黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離為0～0.014，排序為迪慶州>昆明市>文山州，psbA-trnH序列間的遺傳距離為0～0.025，排序為昆明市>迪慶州>文山州，推測ITS和psbA-trnH序列均能顯示黃毛草莓居群遺傳分化與地理分布格局的相關性。ITS序列長度為668 bp，變異位點百分率為1.8%，共有8種單倍型，Hd和π分別為0.894±0.078和0.006，以昆明市黃毛草莓樣品的單倍型最多，為4種;psbA-trnH序列有203 bp，變異位點百分率為2.5%，psbA-trnH序列共有5種單倍型，Hd和π分別為0.788±0.090和0.009，以昆明市黃毛草莓樣品單倍型最多，為3種，表明兩種序列的單倍型均呈現地理分布格局。黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的中性檢驗Tajimas D值分別為-0.673和0.227（P>0.1），表明云南省12個不同地理區域的黃毛草莓居群保持穩定狀態，在截至目前的歷史時間內不存在擴張。【結論】從云南不同地理區域采集的樣品均為黃毛草莓。ITS序列和psbA-trnH序列均可作為黃毛草莓的DNA條形碼，二者的合并序列更能準確鑒定黃毛草莓種，適用于黃毛草莓分子譜系地理學研究。

關鍵詞： 黃毛草莓;ITS序列;psbA-trnH序列;分子鑒定;進化特征

Abstract：【Objective】The molecular identification of Fragaria nilgerrensis samples in different geographical regions of Yunnan was performed by using ribosomal DNA（nrDNA） ITS sequences and chloroplast DNA（cpDNA） psbA-trnH sequences. At the same time，the characteristics of molecular evolution and geographical distribution in different geographi-cal populations were analyzed，which provided with a theoretical basis on molecular identification，protection，and exploitation and utilization of F. nilgerrensis germplasm resources. 【Method】Taking samples of F. nilgerrensis populations from 12 different geographical regions in Yunnan as the research object. Subsequently， PCR was used to amplify the ITS and psbA-trnH sequences from genomic DNAs of these samples，and performed bidirectional sequencing and sequence combination. Then phylogenetic trees were constructed based on ITS and psbA-trnH sequences and their combined sequences，respectively. Finally， the DnaSP ver5.10 software was used to analyze the nucleotide diversity （π） and the number/type/diversity （Hd） of haplotype for ITS and psbA-trnH sequences. At the same time， the neutrality test and the molecular evolution characteristics of F. nilgerrensis populations were analyzed. 【Result】The clustering analysis results based on ITS and psbA-trnH sequences showed that all samples of the F. nilgerrensis populations from 12 different geographical regions were clustered on one branch with the samples from GenBank database，and bootstrap value in this branch was higher than the threshold of 75%，indicating that both sequences could be used for molecular identification of this species germplasm （resources）. The results of the cluster analysis based on the combination sequence of above DNA markers were consistent with the above results，the bootstrap value reached 99%，indicating that the cluster analysis results were more scientific and accurate. The genetic distance between ITS sequences of the F. nilgerrensis populations from different geographical regions was 0-0.014，the order of genetic distance in different regions was Diqing>Kunming>Wenshan. The genetic distance between psbA-trnH sequences was 0-0.025，the order of genetic distance in different regions was Kunming>Diqing>Wenshan. Therefore， it was speculated that both the ITS and psbA-trnH sequences could show the correlation between the genetic differentiation and geographical distribution pattern of F. nilgerrensis populations. The length of the ITS sequence was 668 bp，the mutation rate was 1.8%，the number of haplotypes was eight. Furthermore， the values of Hd and π were 0.894±0.078 and 0.006，respectively. Kunming had the most haplotypes from ITS sequences， with four haplotypes;while the psbA-trnH sequence was 203 bp，the mutation rate was 2.5%，these sequences have five haplotypes，the values of Hd and π were 0.788±0.090 and 0.009，respectively. Kunming had the most haplotypes from psbA-trnH sequences， with three haplotypes. Therefore， the results showed that the haplotypes of both ITS and psbA-trnH sequences presented a specific correlation between evolutionary characteristics and geographical distribution of F. nilgerrensis. The Tajimas D value （neutral test） of the ITS and psbA-trnH sequences were -0.673 and 0.227（P>0.1），respectively. It showed that the populations of F. nilgerrensis from 12 different geographical regions in Yunnan Province were stable and did not experience a recent population expansion event. 【Conclusion】All samples collected from different geographical regions of Yunnan are the species of F. nilgerrensis. The ITS sequence and the psbA-trnH sequence can be used as the DNA barcode，their combined sequence of these DNA barcodes can more accurately identify this species， and both of them are suitable for the molecular phylogeographic study of F. nilgerrensis.

0 引言

【研究意義】黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schltdl. ex J. Gay）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，具有清熱解毒、消炎、祛風止咳等功效，可用于口腔破潰、痢疾、跌打損傷、毒蛇咬傷等癥，是我國自然條件下分布最廣的野生二倍體草莓（鄧明琴和雷家軍，2005;江紀武，2005;雷家軍等，2006），其中，云南省黃毛草莓種質資源極其豐富（中國科學院昆明植物研究所，2006;趙密珍等，2010;楊雷等，2018）。目前，對草莓屬種質鑒定主要依據植株的形態學分類，但形態學分類通常易受主觀因素影響，導致無法準確鑒定，從而影響其多樣性保護及利用（鄧明琴和雷家軍，2005;任保青和陳之端，2010;劉宇婧等，2011）。從分子水平能更加準確地對黃毛草莓進行種質鑒定及不同地理區域的居群遺傳變異分析，對其藥用價值和種質資源開發、利用及保護具有重要意義。【前人研究進展】隨著分子技術的發展，國際生物條形碼聯盟（CBOL）的植物工作小組建議使用葉綠體DNA（cpDNA）和核糖體DNA（nrDNA）ITS序列作為植物研究的DNA條形碼（寧淑萍等，2008;China Plant BOL Group et al.，2011），其中ITS或ITS2序列被中國DNA條形碼植物工作組確定為種子植物的核心條形碼（China Plant BOL Group et al.，2011），同時多種序列片段組合使用也被廣泛用于植物物種的鑒定（Fazekas et al.，2008;Hollingsworth et al.，2011）。2015年版的《中國藥典》將ITS2和cpDNA psbA-trnH序列作為植物類中藥材物種鑒定的DNA條形碼（林爽等，2017），已廣泛用于何首烏屬（白明明等，2012）、石斛屬（彭小鳳等，2015）和黃芩屬（呂澤良等，2017）等中藥材的分子鑒定。目前，國內外關于黃毛草莓的研究主要集中在組織培養（余桂紅等，2002;王燕等，2012）、植株形態學鑒定（鄧明琴和雷家軍，2005;李洪雯等，2012）、核型分析（趙密珍等，2010;陳丙義等，2015）、植株脅迫（Na et al.，2014）、營養成分（李桂香等，2017）和生理生化（徐蘇婷等，2018）等方面，對其進行分子鑒定和遺傳進化分析的文獻較少。Kress等（2005）利用ITS和psbA-trnH的合并序列對有花植物進行分子鑒定，結果發現利用這2種序列可有效識別和鑒定有花植物;Njuguna（2010）使用ITS和psbA-trnH序列對野生草莓進行分子鑒定，結果發現psbA-trnH序列對黃毛草莓具有很好的鑒別能力（Whitaker，2011）。【本研究切入點】目前，鮮見利用ITS和psbA-trnH序列對云南黃毛草莓種質進行分子鑒定及進化特征分析研究的相關報道。【擬解決的關鍵問題】以云南省不同地理區域的黃毛草莓居群樣品為研究對象，PCR擴增其ITS和psbA-trnH序列，并進行雙向測序及序列合并，分別基于ITS和psbA-trnH序列及二者合并序列構建系統發育進化樹，最后對黃毛草莓居群進行中性檢驗及分子進化特征分析，為黃毛草莓種質的鑒定、保護及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為云南省12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品（表1）。主要試劑：E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit（Omega，美國）植物基因組提取試劑盒購自昆明碩陽科技有限公司;Green Taq Mix購自昆明贊納生物科技有限公司。主要儀器設備：MyCycler普通PCR儀（Bio-Rad，美國）、Vortex-Genie? 2 Vortex振蕩儀（MoBio，美國）、小型高速離心機（Thermo，美國）、Syngene G：BOX全自動凝膠成像系統（Syngene，英國）和DYY-12型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1. 2 樣品采集

采集樣品時，從每個地理區域隨機選取10株不同植株個體，將新鮮植株葉片裝于50 mL滅菌管中，4 ℃保存并迅速運回實驗室，于-80 ℃保存備用。

1. 3 DNA提取

利用液氮和研缽對供試材料進行研磨，并利用E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit植物基因組提取試劑盒提取其DNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于 -20 ℃保存備用。

1. 4 PCR擴增

ITS序列的擴增引物為ITS5a（5'-CCTTATCAT TTAGAGGAAGGAG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'）（Kress et al.，2005），psbA-trnH序列的擴增引物為psbA3'f（5'-GTTATGCATGAAC GTAATGCTC-3'）和trnHf（5'-CGCGCATGGTGGAT TCACAATCC-3'）（Hollingsworth et al.，2011）。PCR反應體系：Green Taq Mix 25.0 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正、反向引物各2.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環;72 ℃延伸7 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序（正、反向測通）。

1. 5 統計分析

使用DNAstar對測序峰圖進行手工校對，去除兩端不可靠序列，并將正向和反向序列進行拼接。利用MEGA 6.0對拼接好的序列進行核苷酸組成分析，并基于K2P算法模型和GenBank中已知的野生草莓種序列，通過相鄰算法（NJ）分別構建ITS和psbA-trnH序列的系統發育進化樹，并對其進行1000次重復的自展（Bootstrap）檢驗評價（寧淑萍等，2008;姜玉素等，2019）;應用SequenceMatrix 1.78將ITS和psbA-trnH序列進行合并，并利用PAUP 4.0對合并序列進行同質性檢驗（Vaidya et al.，2011），最后利用MEGA 6.0構建基于合并序列的系統發育進化樹。此外，利用DnaSP 5.10對ITS和psbA-trnH序列進行核苷酸多樣性（π）及單倍型（Haplotype，Hap）數目、類型和多樣性（Hd）分析，并對黃毛草莓居群進行中性檢驗及分子進化特點分析（Librado and Rozas，2009）。

2 結果與分析

2. 1 ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結果

2. 1. 1 基于ITS序列的聚類分析結果 對12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品ITS序列進行PCR擴增及測序，將ITS序列上傳NCBI獲取登錄號，并從GenBank數據庫中下載已發表的10條野生草莓種的有效ITS序列進行聚類分析，構建的系統發育進化樹如圖1所示。12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品ITS序列均與GenBank數據庫中下載的黃毛草莓ITS序列聚在一個分支上，該分支的自展值為90%，遠大于閾值（75%），說明基于ITS序列的聚類分析結果可靠，本研究采集的樣品均為黃毛草莓，與植株形態分類的結果一致。

不同地理區域的黃毛草莓居群樣品ITS序列間的遺傳距離如表2所示。T45與T17-23、T45與T17-46-2間的遺傳距離最遠，均為0.014，T17與T18、T19和T20間的遺傳距離最近，均為0。采自昆明市的4個樣品ITS序列（T1、T5、T6和T7）間的遺傳距離為0.004±0.002，采自文山州的4個樣品ITS序列（T17、T18、T19和T21）間的遺傳距離為0，采自迪慶州的4個樣品ITS序列（T45、T46、T17-23和T17-46-2）間的遺傳距離為0.009±0.003，說明迪慶州黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離高于昆明市和文山州黃毛草莓ITS序列間的遺傳距離，推測ITS序列能闡明黃毛草莓居群的遺傳分化與地理分布格局的相關性。

2. 1. 2 基于psbA-trnH序列的聚類分析結果 將psbA-trnH序列上傳NCBI獲取登錄號，并從GenBank數據庫中下載已發表的10條野生草莓種的有效psbA-trnH序列（其所對應的野生草莓種的類型和數量與選取的10條有效ITS序列一致）進行聚類分析，結果如圖2所示。12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列均能與GenBank數據庫中下載的黃毛草莓psbA-trnH序列聚在一個分支上，該分支的自展值為85%，遠大于閾值（75%），說明基于psbA-trnH序列的聚類分析結果可靠，且基于psbA-trnH序列的聚類結果與基于ITS序列的聚類結果一致，均將采集的樣品鑒定為黃毛草莓，與植株形態分類的結果一致。

不同地理區域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列間的遺傳距離如表3所示。P1與P17、P1與P19、P1與P17-23、P1與P17-46-2間的遺傳距離最遠，均為0.025;而P5與P6、P46與P17-23、P46與P17-46-2、P17-23與P17-46-2間的遺傳距離最近，均為0。采自昆明市的4個樣品psbA-trnH序列（P1、P5、P6和P7）間的遺傳距離為0.010±0.005，采自文山州的4個樣品psbA-trnH序列（P17、P18、P19和P21）間的遺傳距離為0.003±0.003，采自迪慶州的4個樣品psbA-trnH序列（P45、P46、P17-23和P17-46-2）間的遺傳距離為0.005±0.004，說明不同地理區域的黃毛草莓psbA-trnH序列間遺傳距離排序為昆明市>迪慶州>文山州。與ITS序列間的遺傳距離相比，兩種序列均反映出文山州的黃毛草莓樣品間遺傳距離最小，且psbA-trnH序列也可較好地反映文山州的黃毛草莓樣品遺傳差異。因此，兩種序列共同使用能更好地解釋黃毛草莓居群的遺傳分化與地理分布格局的相關性。

2. 2 基于ITS與psbA-trnH的合并序列的聚類分析結果

利用SequenceMatrix 1.78分別將12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品ITS與psbA-trnH序列及從GenBank數據庫中下載的10條野生草莓種的ITS與psbA-trnH序列進行合并，利用PAUP 4.0對合并序列進行同質性檢驗，結果發現合并序列的同質性檢驗（P=0.01）滿足合并閾值，說明所有序列能進行合并分析。基于合并序列使用MEGA 6.0構建系統發育進化樹，結果如圖3所示。將ITS和psbA-trnH序列合并后，12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品均與GenBank數據庫中下載的黃毛草莓聚在同一分支，該分支的自展值為99%，遠大于閾值（75%）及基于ITS（自展值為90%）和psbA-trnH（自展值為85%）分別構建的系統發育進化樹自展值，且聚類結果與分別基于ITS和psbA-trnH序列的聚類分析結果一致。因此，今后可使用多種序列組合的DNA條形碼，并結合植株形態學特征進行草莓種質鑒定，以保證鑒定的準確性。

2. 3 ITS序列特征及單倍型分析結果

利用MEGA 6.0對所有的黃毛草莓ITS序列進行比對，對位排列后得到668 bp的恒定序列，其中包括649個保守位點、10個變異位點、7個簡約信息位點和9處插入/缺失位點，變異位點百分率為1.80%，G+C含量為63.2%～63.8%。其中，9處插入/缺失位點分別位于ITS序列的2、5、6、8、12、13、14、20和665 bp位點。ITS序列共有8種單倍型（表4），Hd為0.894±0.078，π為0.006。8種單倍型中，Hap5分布于文山州廣南縣（T17）、文山州富寧縣（T18）、文山州硯山縣（T19）和文山州馬關縣（T21）的黃毛草莓樣品中，Hap8分布于迪慶州維西縣保和鎮（T17-23）和迪慶州維西縣白濟汛鄉（T17-46-2）的黃毛草莓樣品中，其余單倍型均為私有單倍型。Hap1只存在于昆明市嵩明縣的黃毛草莓樣品（T1）中，Hap2只分布于昆明市盤龍區的黃毛草莓樣品（T2）中，Hap3只分布于昆明市富民縣的黃毛草莓樣品（T3）中，Hap4只分布于昆明市祿勸縣的黃毛草莓樣品（T4）中，Hap6只分布于迪慶州德欽縣的黃毛草莓樣品（T45）中，Hap7只分布于迪慶州香格里拉市的黃毛草莓樣品（T46）中（表4）。綜上所述，昆明市黃毛草莓樣品存在4種單倍型（Hap1、Hap2、Hap3和Hap4），文山州黃毛草莓樣品存在1種單倍型（Hap5），迪慶州黃毛草莓樣品存在3種單倍型（Hap6、Hap7和Hap8）。

2. 4 psbA-trnH序列特征及單倍型分析結果

利用MEGA 6.0對所有的黃毛草莓psbA-trnH序列進行比對，對位排列后得到203 bp的恒定序列，其中包括198個保守位點、5個變異位點和3個簡約信息位點，無插入/缺失位點，變異位點百分率為2.5%，G+C含量為18.7%～19.7%。psbA-trnH序列共有5種單倍型（表5），Hd為0.788±0.090，π為0.009。Hap4分布于文山州廣南縣（P17）、文山州硯山縣（P19）、迪慶州維西縣保和鎮（P17-23）、迪慶州香格里拉縣（P46）和迪慶州維西縣白濟汛鄉（P17-46-2）的黃毛草莓樣品;Hap3分布于昆明市祿勸縣（P7）、文山州富寧縣（P18）和文山州馬關縣（P21）的黃毛草莓樣品;Hap2分布于昆明市盤龍區（P5）和昆明市富民縣（P6）的黃毛草莓樣品;Hap1僅分布于昆明市嵩明縣（P1）的黃毛草莓樣品，Hap5僅分布于迪慶州德欽縣（P45）的黃毛草莓樣品（表5）。綜上所述，psbA-trnH序列的5種單倍型中，單倍型Hap4的黃毛草莓樣品數量最多，昆明市黃毛草莓樣品存在3種單倍型（Hap1、Hap2和Hap3），文山州黃毛草莓樣品存在2種單倍型（Hap3和Hap4），迪慶州黃毛草莓樣品存在2種單倍型（Hap4和Hap5）。

2. 5 ITS序列和psbA-trnH序列的進化特征分析結果

運用DnaSP 5.10分別對黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列進行中性檢驗（Tajimas D），檢測不同地理區域的黃毛草莓居群穩定性，并分析序列中分離位點數目與核苷酸多樣性之間的關系。其中，黃毛草莓ITS序列的Tajimas D值為-0.673（P>0.1），表明12個不同地理區域的黃毛草莓居群保持穩定狀態，在截至目前的歷史時間內不存在擴張。黃毛草莓ITS序列的歧點分布情況如圖4-A所示。與期望值（Exp）相比，觀測值（Obs）曲線呈現多峰，說明居群在截至目前的歷史時間內不存在擴張或持續增長，與中性檢驗結論一致。

黃毛草莓psbA-trnH序列的Tajimas D值為0.227（P>0.1），推測12個不同地理區域的黃毛草莓居群保持穩定狀態，在截至目前的歷史時間內不存在擴張。黃毛草莓psbA-trnH序列的歧點分布情況如圖4-B所示。與期望值（Exp）相比，觀測值（Obs）曲線呈現多峰，得到的曲線呈現多峰，說明居群在歷史時間內不存在擴張或持續增長，與中性檢驗結論一致。

可見，云南省不同地理區域的黃毛草莓居群保持穩定狀態，在截至目前的歷史時間內不存在擴張。

3 討論

3. 1 黃毛草莓的分子鑒定及DNA分子條形碼

目前，國內學者主要依據傳統植物形態學方法，從植株莖、葉、花和果等組織器官形態特征對野生草莓進行種質鑒定（代漢萍等，2007;趙密珍等2010）及種質資源收集（蘇代發等，2018）。由于部分野生草莓種質的植株具有相似的形態學特征（雷家軍等，2008）或采集時形態學指標收集不全（德慶措姆等，2012），導致無法準確地分類鑒定。本課題組在對云南省野生草莓進行收集時，也發現大部分野生草莓植株在沒有花和果實的情況下很難通過植株形態學特征準確鑒定到種的水平。近年來，隨著植物DNA分子技術的發展，傳統植株形態學分類的瓶頸逐漸被攻克，不僅可快捷、準確地實現植物物種鑒定及分類，還可從分子水平探究植物的親緣關系、系統發育進化及遺傳多樣性等。國外對野生草莓分子水平的研究起步較早，已有學者利用ITS和psbA-trnH序列對草莓屬的栽培品種和野生種進行分子鑒定和系統發育研究（Eriksson et al.，1998;Potter et al.，2002;Njuguna，2010）。本研究首次使用ITS和psbA-trnH序列對云南省自然分布的野生黃毛草莓種質資源進行分子鑒定，并將供試樣品的ITS和psbA-trnH序列進行合并，構建了系統發育進化樹，結果顯示，12個不同地理區域的黃毛草莓樣品均與GenBank數據庫中下載的黃毛草莓聚在同一分支，該分支的自展值為99%，遠大于基于ITS（自展值為90%）和psbA-trnH（自展值為85%）分別構建的系統發育進化樹自展值，表明兩種序列合并可提高黃毛草莓分子鑒定結果的可信度。因此，ITS和psbA-trnH可作為黃毛草莓的DNA分子條形碼。該結果與Potter等（2000）、Njuguna（2010）的研究結論相似。雖然本研究黃毛草莓分子鑒定結果與形態學分類鑒定結果一致，但分子鑒定更加快捷，不易受主觀因素影響。

3. 2 黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的進化特征

韓柏明等（2012）、Meng等（2015）、徐蘇婷（2017）分別利用SSR分子標記對草莓屬不同種之間的親緣關系和遺傳多樣性進行分析。隨著分子測序技術的完善，現多用nrDNA和cpDNA的序列片段進行相關研究。本研究中12個不同地理區域的黃毛草莓樣品ITS序列間遺傳距離為0～0.014，從大到小排序為迪慶州（0.009±0.003）>昆明市（0.004±0.002）>文山州（0）;12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品psbA-trnH序列間的遺傳距離為0～0.025，從大到小排序為昆明市（0.010±0.005）>迪慶州（0.005±0.004）>文山州（0.003±0.003），說明不同地理區域的黃毛草莓遺傳特征存在差異，推測云南省黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的遺傳特性與其地理分布具有一定的相關性。白明明等（2012）、許子欣等（2018）基于ITS序列和psbA-trnH序列分別對不同地理區域的巴戟天和何首烏進行遺傳特性分析，結果也發現二者的遺傳變異與地理分布存在一定的相關性。

12個不同地理區域的黃毛草莓居群樣品ITS序列共有8個單倍型，其中昆明市存在4種單倍型（Hap1、Hap2、Hap3和Hap4），文山州僅存在1種單倍型（Hap5），迪慶州存在3種單倍型（Hap6、Hap7和Hap8）;psbA-trnH序列共有5種單倍型，其中Hap4分布最廣，昆明市存在3種單倍型（Hap1、Hap2和Hap3），文山州存在2種單倍型（Hap3和Hap4），迪慶州存在2種單倍型（Hap4和Hap5）。依據本研究兩種序列的單倍型分布來看，云南省黃毛草莓區域性分布特征明顯，不同地理區域具有自己獨特的單倍型。該結果與柏國清等（2017）、林爽等（2017）和劉振等（2018）分別對秦巴山區漆樹、破布葉和湖南茶樹資源的研究結論一致。此外，本研究黃毛草莓ITS和psbA-trnH序列的歧點分布分析結果均表明，云南省12個不同地理區域的黃毛草莓居群保持穩定狀態，在截至目前的歷史時間內不存在擴張。推測其原因是由于云南省不同地理區域的地形地貌復雜，海拔差異顯著、氣候和環境因子異質性等特征為黃毛草莓提供了不同的生境條件，維持了黃毛草莓各自的遺傳特性。也正因為云南省獨特的地理氣候資源，致使不同地理區域的黃毛草莓ITS序列和psbA-trnH序列存在豐富的遺傳多樣性。Njuguna等（2013）、Qiao等（2016）分別利用轉錄組學和基因組學技術研究發現草莓屬植物可能起源于東亞地區，而本研究中使用的DNA條形碼能較好地探討黃毛草莓地理分布格局。因此，在今后的研究中，應加大各居群采樣量，并使用多種分子標記共同探討黃毛草莓譜系地理學的相關問題，為解釋草莓屬的分子進化和地理分布格局提供理論依據。

4 結論

從云南不同地理區域采集的樣品均為黃毛草莓。ITS序列和psbA-trnH序列均可作為黃毛草莓的DNA條形碼，二者合并序列更能準確鑒定黃毛草莓種，適用于黃毛草莓分子譜系地理學研究。

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（責任編輯 陳 燕）