煙堿手性異構(gòu)體的分離分析

楊 強，張 箭，聶海英，黃志萍，李 江

（1.湖北和諾生物工程股份有限公司，湖北 恩施 445000；2.湖北航天化學技術(shù)研究所，湖北 襄樊 441003）

手性藥物是指具有相同的分子結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)和化學組成，但立體結(jié)構(gòu)互為鏡像的一類藥物的總稱。煙堿是一種吡啶型生物堿，是重要的醫(yī)藥、化工原料，主要存在于煙草中，可用作高效低毒的天然殺蟲劑，也是治療老年癡呆癥、帕金森癥、抑郁癥的有效藥物。天然煙堿是R（-）左旋手性分子，一般從煙草下腳料中提取而得[1-2]。而人工合成的煙堿大多數(shù)是左、右旋異構(gòu)體等量的外消旋煙堿。右旋煙堿與左旋煙堿具有同樣的生理作用，并具有更低的生物毒性。因而有人利用手性原料和選擇性反應(yīng)合成右旋煙堿，也有人合成外消旋煙堿，并利用煙堿左、右旋異構(gòu)體生成有機酸鹽晶體的溶解性差異對異構(gòu)體進行分離[3-5]。

煙堿分析一般采用氣相色譜法和液相色譜法[6-7]，美國藥典和歐洲藥典中天然煙堿的分離分析也采用氣相色譜法和液相色譜法[8-9]。也有人通過固相/液相微萃取、分子印跡材料對樣品進行前處理純化后，再采用紫外分光光度法、氣相色譜法和液相色譜法進行分析，但上述方法不能分離煙堿手性異構(gòu)體[10]。β-環(huán)糊精分子中含有7個（奇數(shù)）葡萄糖單元,這種非對稱結(jié)構(gòu)使其對大多數(shù)手性成分具有區(qū)分能力。劉百戰(zhàn)[11]用DB-1柱，一根全甲基化β-環(huán)糊精手性柱，采用二維氣相色譜法成功分離了煙堿手性異構(gòu)體，R（+）尼古丁（煙堿）的檢測限約為0.5%。但該法手性柱如果初溫低于50℃，時間大于15min，全甲基化環(huán)糊精固定相開始固化，會導致手性分離能力顯著下降。因此，當初溫低于50℃時，要先把柱溫提高，使環(huán)糊精衍生物液化，然后再降到低溫，立即開始樣品分析。由于外消旋煙堿多采用有機酸鹽的方式進行分離，煙堿鹽易溶于水，在氣相色譜中較難氣化，故本文采用反相液相色譜手性柱分離分析煙堿手性異構(gòu)體，建立煙堿手性異構(gòu)體靈敏、準確、簡單、快速的分離分析方法，以便于在分離外消旋煙堿時評價其分離效果。

1 實驗部分

1.1 儀器及實驗條件

高效液相色譜 （HPLC）儀，美國安捷倫（Agilent，USA）公司1260 infinity型，配備二極管陣列紫外檢測器，檢測波長260 nm。色譜柱：CHIRALPAK IG-3，粒徑 3μm，Φ4.6mm×250mm，大賽璐（DAICEL）（中國）投資公司。流動相:70%20 mmol/L碳酸氫銨水溶液+30%乙腈；流速：0.5mL/min。樣品用流動相溶解，濃度為0.0005～0.005g/mL，進樣量 2μL。

10mL，25 mL容量瓶若干，5 mL刻度移液管一支。

1.2 試劑與材料

天然左旋煙堿，湖北和諾生物工程股份有限公司生產(chǎn)；外消旋煙堿，煙堿有機酸鹽，湖北航天化學技術(shù)研究所制備；乙腈，色譜純，迪馬科技公司；碳酸氫銨，分析純，西隴科學股份有限公司；實驗用水符合GB/T 6682中一級水要求。

1.3 標準溶液的配制

采用高純度天然煙堿作為標準樣品，純度用氣相色譜歸一法檢測在99.5%以上，樣品用流動相溶解，質(zhì)量濃度為0.0001～0.01 g/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件選擇

2.1.1 色譜分離方法選擇

1）GC法，不同極性毛細管色譜柱；

2）HPLC法，正相和C18、NH2反相色譜柱；

3）HPLC法，采用手性柱。

采用方法1）和2），天然左旋煙堿和外消旋煙堿均只有一個峰，且保留時間相同，無法分離手性異構(gòu)體，而方法3，可以將左旋和右旋煙堿異構(gòu)體分開。因而采用HPLC法手性柱進行分析。

2.1.2 色譜柱與流動相選擇

2.1.2.1 色譜柱

由于煙堿及其鹽易溶于水，選擇反相色譜條件。大賽璐的色譜柱CHIRALPAK IG-3為多糖衍生物硅膠涂敷型手性反相色譜柱，柱效較為穩(wěn)定，且可分離煙堿異構(gòu)體，故選擇大賽璐CHIRALPAK IG-3手性色譜柱。

2.1.2.2 流動相

由于煙堿為弱堿性，選用碳酸氫銨水溶液作為流動相，煙堿可以保持在 pH為9～10的堿性環(huán)境中，可以抑制煙堿上堿性的氨基基團的離子化，煙堿不易水解成離子，避免縮短保留時間，降低分辨率；保持煙堿分子狀態(tài)，可確保保留時間較長，提高分辨率。選擇20 mmol/L碳酸氫銨水溶液90%～50%，乙腈10%～50%范圍進行實驗。結(jié)果表明：流動相為70%碳酸氫銨水溶液，30%乙腈時，煙堿色譜出峰時間合適，不僅左旋和右旋異構(gòu)體可以分開，而且可以與雜質(zhì)進行有效分離，通過天然煙堿定性，確定左、右旋煙堿出峰位置，如圖1所示。圖1中還可看出，不同煙堿鹽中左右旋含量不同：結(jié)晶的（s）酒石酸煙堿鹽（Nicotine tartrate）左旋體右旋體大于50%；未結(jié)晶的（l）L-對甲二苯甲酰酒石酸煙堿鹽 （Nicotine-O,O’-di-p-toluoyl-L-tartrate，L-PTT）右旋體大于50%，說明可以通過煙堿鹽結(jié)晶性和溶解性的不同來分離煙堿手性異構(gòu)體。

圖1 典型煙堿（鹽）樣品色譜分離圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍和檢出限

以高純左旋煙堿為標準品，用純水配制濃度范圍為0.0001～0.01 g/mL標準溶液，以峰面積為縱坐標（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標（x，g/mL）繪制標準曲線（見圖2）。結(jié)果表明，標準曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999。以信噪比為3和10時的進樣濃度為最低檢出含量和最低定量含量，最終計算得出該方法的檢出限為 9.3×10-8g/mL，定量限為 1.4×10-8g/mL。

2.2.2 方法準確度

由于外消旋煙堿手性異構(gòu)體結(jié)構(gòu)對稱，其紫外特征峰和吸收強度與天然左旋煙堿一致（見圖3），煙堿左右旋異構(gòu)體的響應(yīng)因子為1.01，可以用高純天然左旋煙堿作為標準品，采用外標法進行定量，也可用歸一化法對手性異構(gòu)體相對含量進行定量。方法準確度通過在一批已測含量的消旋煙堿樣品中加入左旋煙堿，測定其回收率進行驗證，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，左旋異構(gòu)體的加標回收率為 95.2%～103.8%，相對標準偏差為3.9%，平均回收率為99.4%，準確度較好。

2.2.3 方法精密度

圖2 標準曲線

圖3 不同煙堿紫外特征吸收譜圖

表1 HPLC測定煙堿手性異構(gòu)體方法準確度Table 1 The accuracy of the methods for quantitative analysis of Nicotine chiral isomers by HPLC

對同一批外消旋煙堿進行測定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，手性異構(gòu)體標準偏差（SD）和相對標準偏差 （RSD）均小于0.5%，方法精密度較好。

2.3 方法實用性

用不同有機酸與外消旋煙堿反應(yīng)生成的鹽樣品進行了檢測，結(jié)果見表3。從表3中看出，不同相態(tài)煙堿鹽中左右旋煙堿含量有明顯差別：如結(jié)晶的酒石酸煙堿鹽（Nicotine tartrate（s）） 左旋煙堿達到89%，而液態(tài)未結(jié)晶的L-PTT（l）、未結(jié)晶的5磺基水楊酸煙堿鹽（Nicotine 5-sulfosalicylate dihydrate（l））右旋煙堿分別為61.60%、55.73%，大于50%，說明不同有機酸煙堿鹽結(jié)晶性明顯不同，可以通過重結(jié)晶分離左右旋煙堿。檢測結(jié)果可以區(qū)別樣品的分離效果，實用性較好。

表2 HPLC測定外消旋煙堿方法精密度Table 2 The precision of the methods for quantitative analysis of Nicotine chiral isomers by HPLC

表3 不同樣品手性異構(gòu)體含量歸一化測定結(jié)果Table 3 The normalized results of laevoisomer and dextroisomer in different samples

3 結(jié)論

1）應(yīng)用反相手性色譜柱的液相色譜法可以有效分離煙堿左、右旋手性異構(gòu)體；

2）采用外標法定量煙堿左、右旋手性異構(gòu)體含量，方法準確度和精密度較好；只需要相對含量時，選用歸一化法更簡便。