超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定沉香中白木香酸含量

黎嘉茗，黃國凱，李 華

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663)

沉香是一種名貴中藥，味辛、苦，性溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效。其商品主要為國產(chǎn)沉香(瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材[1])和進(jìn)口沉香(瑞香科植物沉香AquilarlaagallochaRoxb.含有樹脂的木材[2])。除藥用外，沉香還常作為天然香料、工藝品原材料等用途，市場(chǎng)需求量較大。由于沉香結(jié)香條件苛刻，產(chǎn)量較低，野生資源已經(jīng)基本枯竭，不能滿足藥用需求，目前藥用沉香以人工結(jié)香為主。此外，流通領(lǐng)域中還充斥著以其他木材充偽或非法添加松香的沉香，嚴(yán)重影響了用藥的安全和質(zhì)量。

沉香主要化學(xué)成分包括倍半萜類化合物、色酮類化合物、芳香族類化合物、脂肪酸類化合物等。其中倍半萜類化合物[3]和2-(2-苯乙基)色酮[4]是其主要的藥理活性成分。沉香藥材現(xiàn)行法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]以浸出物含量作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，據(jù)研究表明，沉香的浸出物含量與其特征性成分-白木香酸的含量呈正相關(guān)[5]，白木香酸的有無及含量的高低，能夠反映沉香樣品的品種真?zhèn)渭百|(zhì)量?jī)?yōu)劣。本文建立了沉香中白木香酸的UPLC-Q-TOF定量檢測(cè)方法，對(duì)全國藥品流通領(lǐng)域中的69批沉香樣品進(jìn)行測(cè)定，為完善沉香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 6540 超高分辨率精確質(zhì)量四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent 1290超高效液相色譜系統(tǒng)，美國)；Milli-Q超純水機(jī)；KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)；XS205電子天平(Mettler Toledo)。

1.2 試藥

沉香藥材69批，從全國XX省份的零售藥店，飲片生產(chǎn)企業(yè)和中藥制劑生產(chǎn)企業(yè)中收集，樣品信息見表1。白木香酸對(duì)照品由廣東藥科大學(xué)高曉霞副教授提供，經(jīng)HPLC面積歸一化法計(jì)算，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.83%；乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)，LCMS級(jí)甲酸(Fluka公司)，甲醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 沉香樣品信息

續(xù)表1

編號(hào)收集地品種鑒定浸出物含量(%)白木香酸含量(%)41浙江合格品10.60.0642浙江合格品10.80.0143安徽合格品11.60.3044青海非法添加21.10.0045安徽劣質(zhì)品7.50.0146天津合格品15.60.0547天津合格品12.40.0848湖北劣質(zhì)品10.10.0949安徽合格品12.50.1150天津合格品15.20.0551安徽合格品25.20.0552安徽合格品26.10.0853河南非法添加20.40.1554安徽合格品10.90.0955安徽劣質(zhì)品9.70.0056安徽合格品26.20.0257四川劣質(zhì)品10.30.0858安徽合格品10.70.0159江蘇合格品12.60.0360安徽非法添加19.80.0061貴州劣質(zhì)品6.70.0462湖北合格品12.70.0663四川合格品13.20.0764山東劣質(zhì)品11.20.0865廣東合格品10.70.0366廣東劣質(zhì)品9.20.0467安徽非法添加23.70.0068安徽劣質(zhì)品8.70.0069吉林合格品16.80.11

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilient Zorbax C18(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A)，梯度洗脫條件，0～6 min，40%B；6～6.5 min，40%～90%B；6.5～10 min，90%B。流速：0.35 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正模離子掃描模式，干燥氣流速為8.0L/min；干燥氣穩(wěn)定為350 ℃；霧化氣壓力為35psi；毛細(xì)管電壓正離子模式4 000 V；錐孔電壓：75V；碎裂電壓：130V。Targeted掃描模式，Targeted分子離子為235.169 2 m/z。一級(jí)掃描范圍100～1000 m/z，二級(jí)掃描范圍50～300 m/z，碰撞能量：20 V；準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用TFANH4、Purine、HP-0921、N/A的混合參比溶液，ESI+：m/z 121.050 873、922.009 798。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取白木香酸對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.188 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

取沉香粉末(過40目篩)約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加乙酸乙酯10 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)90 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。置于分液漏斗中，取5%碳酸鈉溶液振搖提取3次，每次10 mL，合并碳酸鈉溶液。加入適量2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH=9.0，置于分液漏斗中，取乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并碳酸鈉溶液。加入適量2 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH=1.0，取乙酸乙酯振搖萃取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液。置于80 ℃水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法專屬性實(shí)驗(yàn)

碎裂電壓為130 V，碰撞能量20 V。在優(yōu)化條件下，對(duì)白木香酸對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。[M-H2O+H]+峰235.1692 m/z有最大響應(yīng)，一級(jí)質(zhì)譜如圖1。二級(jí)質(zhì)譜如圖2所示，最大的兩個(gè)碎片離子為149 m/z、217 m/z。以235.269 2 m/z為檢測(cè)離子，149 m/z和217 m/z為輔助定性離子，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。正品(編號(hào)X)及偽品(編號(hào)X)一級(jí)EIC見圖3、圖4，正品可以檢測(cè)出白木香酸，而偽品無法檢測(cè)出白木香酸。

圖1 白木香酸一級(jí)質(zhì)譜

圖2 白木香酸二級(jí)質(zhì)譜

圖3 沉香合格樣品一級(jí)EIC

圖4 沉香偽品一級(jí)EIC

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取白木香酸對(duì)照品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，白木香酸的平均峰面積為50 708.04，RSD為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取沉香樣品(編號(hào)：2015A18501)，分別按照“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，白木香酸峰面積平均值為275 233.4，RSD為2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批沉香樣品(編號(hào)：2015A18501)供試品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，白木香酸峰面積平均值為277241，RSD為1.1%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品測(cè)定

分別取69批沉香樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄譜圖，檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 討論

69批沉香樣品，按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，44批為合格品，其白木香酸平均含量為0.21%。3批為偽品，均未檢出白木香酸。22批為劣質(zhì)沉香，有7批未檢出白木香酸峰，經(jīng)橫切面顯微觀察，確認(rèn)樣品為不含(或含極少)樹脂的白木香木材；其余15批劣質(zhì)沉香的白木香酸平均含量為0.09%。

通過對(duì)比檢驗(yàn)結(jié)果可知，白木香酸可作為沉香的專屬性成分，其在一定程度上還能反映樣品中樹脂含量的多少，可作為評(píng)判沉香藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的依據(jù)。