活源方對CAG大鼠胃黏膜TLR4信號通路表達的影響

夏鵬飛，丁 念，梁 金，張覺人

(武漢市中醫醫院，湖北 武漢 430014)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis CAG)是一種消化系統常見病，是以胃黏膜及腺體萎縮為主要表現的胃部炎癥反應。國內外流行病學研究表明，年齡、Hp感染、膽汁反流、生活、飲食習慣、精神等多種因素對CAG的發生有不同程度的影響。慢性萎縮性胃炎在中醫學中屬痞滿、胃脘痛、嘈雜等范疇。關于這一疾病的表現在古籍中早有記載，如《靈樞·邪氣臟腑病形》載：“胃病者，腹脹，胃脘當心而痛。”中醫學認為，本病發病多與飲食不節、脾胃虛弱、勞倦太過、情志不暢以及先天稟賦等有關。CAG以腺體萎縮為主要表現，目前發病機制尚未明確。但CAG可經過長期慢性、多階段演變過程逐漸進展為胃癌，因此，CAG被認為是(早期)胃癌前病變，對 CAG的早期預防以及治療至關重要。隨著時代的發展，物質充足、快節奏的生活方式，導致人們飲食、作息不規律，導致CAG患者越來越多。目前，西醫對于CAG尚無根治方法，主要采用弱酸治療、抗幽門螺桿菌等對癥治療，但因此病病程長、易反復、難治愈、易癌變，加之Hp逐漸增強的耐藥性，故常規治療具有一定的局限性[1]。有實驗研究發現，胃復春片對胃黏膜再生有促進作用，能夠使病變血液循環得到改善，有效消除炎癥，提升血清胃泌素、胃動素水平，從而達到治療目的[2]。本研究通過建立CAG大鼠模型，觀察“活源方”對大鼠胃黏膜病理、血清TNF-α、IL-6含量及TLR4信號通路表達的影響，評估活源方治療慢性萎縮性胃炎的療效，為防治慢性萎縮性胃炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物及試劑 活源方顆粒劑組成：木香、砂仁、石斛、沙參、黨參、白術、薏苡仁、佛手、麥芽、丹參、百花蛇舌草、莪術、甘草(按比例9∶9∶10∶30∶12∶9∶30∶10∶15∶10∶15∶5∶8配制，由武漢市中醫醫院制劑室提供)；胃復春(國藥準字Z20040003，杭州胡慶余堂生產)；TNF-α、IL-6、TLR4的ELISA試劑盒(武漢英顥科技有限公司提供)。

1.1.2 實驗動物 清潔級12周齡雄性CAG大鼠 120只，體重(200±10)g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(鄂)2017-0006，實驗在武漢市中醫藥研究所國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 模型制作參照第二軍醫大學李兆申等[3]及中國中醫科學院中醫基礎理論研究所陳小野[4]的方法改進，進行綜合法造模，方法如下：所有大鼠均以0.2%的脫氧膽酸鈉溶液灌胃，用量為1.5 mL/d，與脫氧膽酸鈉溶液灌胃間隔5 h，再用50 ℃熱水2 mL/d灌胃，并且加用饑飽失常(單日禁食禁水，雙日給予足量食水)和勞倦過度(后4周起，將大鼠每日置于溫水中游泳10 min)，連續造模12周后，隨機抽取3只大鼠，麻醉后剖腹取胃，切片并在光鏡下觀察，確定大鼠造模成功。

1.2.2 造模成功標準 經病理確診，慢性萎縮性胃炎的病理診斷標準符合《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002年版)：①固有腺體萎縮；②黏膜肌層增厚；③可有腸上皮化生或假幽門腺上化生；④固有膜炎癥；⑤可有淋巴濾泡形成。

1.2.3 動物分組 空白對照組(不造模+生理鹽水灌胃)；模型對照組(造模+生理鹽水灌胃)；陽性對照組(造模+胃復春水溶液灌胃)；活源方低劑量組(造模+活源方低劑量灌胃)；活源方中劑量組(造模+活源方中劑量灌胃)；活源方高劑量組(造模+活源方高劑量灌胃)；每組20只。

1.2.4 給藥方法 空白對照組不造模，每只大鼠灌服生理鹽水2 mL/d；模型對照組造模后，每只大鼠灌服生理鹽水2 mL/d；胃復春組造模后，每只大鼠灌服胃復春水溶液，劑量為144 mg/kg；活源方低、中、高組造模后，連續用活源方顆粒劑灌胃，分別給與6 mL/d、10 mL/d、14 mL/d給大鼠灌胃。30 d為1個療程，共進行2個療程，各組在第60天結束后禁食12 h，斷頭取血、取胃后，處死。

2 觀察指標

2.1 一般狀態

在實驗期間，分別于造模成功后給藥的第1天、第30天、第60天稱量并記錄各組大鼠體重。對各組大鼠的體重、毛色、精神狀態、食欲、大便及活動情況進行觀察。

2.1.1 胃黏膜組織學肉眼觀察 給藥第60天結束后禁食 12 h，大鼠斷頭取血，各組大鼠處死后，剖取全胃，沿胃大彎側打開，生理鹽水沖洗，平鋪，觀察胃體、胃黏膜皺襞形態改變、胃黏膜色澤，以及出血點情況及糜爛和潰瘍情況。

2.1.2 肉眼及病理療效評定 參考國家中醫藥管理局的《24個專業105個病種中醫診療方案》：肉眼胃黏膜療效評定：分別對肉眼下紅斑、糜爛、出血、花斑、蒼白、血管顯露、黏膜結節等情況加以統計，計算各單個肉眼所見改善等級及總積分改善程度：①痊愈：胃黏膜恢復正常；②顯效：胃黏膜病變積分減少2級以上；③有效：胃黏膜病變積分減少1級；④無效：胃黏膜病變無改變或加重。

2.1.3 血清中TNF-α、IL-6、TLR4含量 各組大鼠斷頭取血，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各項數據，按試劑盒說明書步驟操作。

2.2 統計分析

3 結果

3.1 一般狀態

空白對照組體重基本無明顯變化，毛色光澤、精神好、活潑好動、食欲佳、大便正常。模型組體重逐漸減輕，形體消瘦，毛色枯槁無光澤、精神萎靡、昏昏欲睡、食欲差、大便溏稀。胃復春組體重逐漸增加、毛色光澤、精神狀態良好、食欲良好、大便正常。活源方組體重逐漸增加、毛色光澤、精神狀態良好、食欲良好、大便正常。

3.2 胃黏膜組織學肉眼觀察

空白組大鼠胃黏膜呈粉紅色，皺襞整齊，厚度適中，未見明顯出血點，彈性良好。模型組大鼠胃黏膜呈灰白色，皺襞低平紊亂，厚度變薄，可見散在出血點，彈性差。胃復春組及活源方各劑量組胃黏膜色澤、形態及彈性度均出現不同程度的好轉，其中以活源方高劑量組改善最為明顯。各組大鼠胃黏膜情況，見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜組織學肉眼觀察

3.3 肉眼及病理療效評定

依據上述療效評定標準，對陽性對照組，活源方低、中、高劑量組進行療效評定，計算出總有效率。陽性對照組大鼠總數20只，其中治療痊愈3例、顯效10例、有效5例、無效2例，有效率90%。低劑量治療組大鼠總數20只，治療痊愈2例、顯效8例、有效6例、無效4例，有效率80%；中劑量治療組大鼠總數20只，治療痊愈3例、顯效11例、有效4例、無效2例，有效率90%；高劑量治療組大鼠總數20只，治療痊愈6例、顯效11例、有效2例、無效1例，有效率95%。由此可見，治療組病理組織學總有效率高于對照組(P<0.05)。

3.4 血清TNF-α、IL-6含量

各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量指標變化情況，見表2。

組別TNF-αIL-6空白組14.08±0.5435.24±3.15模型組32.10±0.321)51.45±2.921)陽性對照組21.13±0.4143.58±3.12低劑量治療組25.13±0.232,3)45.67±1.562,3)中劑量治療組24.62±0.252,3)45.36±1.932,3)高劑量治療組22.46±0.362,3)44.05±2.532,3)

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽性對照組比較，3)P>0.05。

結果表明，模型組與空白組血清TNF-α、IL-6含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與模型組血清TNF-α、IL-6含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與陽性對照組血清TNF-α、IL-6含量無明顯差異(P>0.05)。

3.5 TLR4信號通路表達

各組大鼠胃黏膜組織TLR4比較，見表3。

組別TLR4空白組0.61±0.13模型組1.16±0.151)陽性對照組0.91±0.17低劑量治療組1.04±0.122,3)中劑量治療組0.95±0.232,3)高劑量治療組0.89±0.162,3)

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽性對照組比較，3)P>0.05。

結果表明，模型組與空白組血清TLR4含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與模型組血清TLR4含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與陽性對照組血清TLR4含量無明顯差異(P>0.05)。

4 討論

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是人類免疫系統中重要的膜受體，目前被認為是哺乳動物細胞中唯一將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞的跨膜蛋白[5]。TLRs可識別病原相關的外源性配體及某些內源性配體。在TLRs家族成員中，與CAG發生、發展關系最為密切的是TLR4。在受到配體刺激的情況下可傳遞炎癥信號，并導致炎癥細胞浸潤及炎癥因子釋放[6]。血清IL-6、TNF-α是常用于評估胃黏膜損傷嚴重程度的促炎細胞因子，以上指標數值的變化對評估治療慢性萎縮性胃炎的療效具有重要參考意義。在實驗中，模型組TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達升高，與空白組比較差異均有統計學意義(P<0.05);活源方各治療組與模型組比較，活源方各治療組血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達均有下降，差異有統計學意義(P<0.05)，表明大鼠胃黏膜受到損傷后，機體產生了一系列反應，給藥治療后，陽性對照組和活源方各治療組均能糾正這些指標，表明活源方能調整機體出現的紊亂，修復損傷的胃黏膜，達到治療慢性萎縮性胃炎的效果。

活源方由木香、砂仁、石斛、沙參、黨參、白術、薏苡仁、佛手、麥芽、丹參、百花蛇舌草、莪術、甘草組成，各類中藥相互作用、相輔相成，共同調理脾胃氣機，改善脾胃功能。其中木香味辛、性溫，歸脾、大腸、三焦經，主行氣、止痛、健脾消食，可促進胃腸蠕動、調整胃腸動力以鎮痛[7]。砂仁味辛、性溫，歸脾、胃、腎經，主化濕開胃、溫脾止瀉、鎮痛消炎，促進胃腸蠕動，同時可以抑制胃蛋白和胃潰瘍中酶抑制導致的胃黏膜細胞障礙、急性胃黏膜損傷等胃潰瘍癥狀[8]。石斛性味甘淡微咸，寒，歸胃、腎、肺經，可益胃生津、滋陰清熱。石斛能明顯刺激脾淋巴細胞增殖，促進脾淋巴細胞中的白細胞介素-2及干擾素-γ的活性，具有抗炎、免疫作用[9]。沙參甘而微苦，有滋補作用。黨參性甘，補中益氣，和胃生津。黨參中分離得出的菊糖型果聚糖CP-A對乙醇所致的急性胃潰瘍模型大鼠3級胃黏膜損傷、高潰瘍指數及胃黏膜出血損傷有顯著改善作用[10]。白術、丹參有止痛之效，白術能調節胃腸道運動，調節腸道微生態，修復胃腸道黏膜損傷，并有抗炎等作用[11]。薏苡仁味甘、淡，性涼，利水滲透濕，健脾止瀉。佛手有止痛和胃、燥濕化痰的功效，能增強體質、提高免疫機能[12]。麥芽行氣消食，健脾開胃。百花蛇舌草、莪術有抗菌消炎、抗腫瘤作用。甘草味甘，性平，可補脾益氣，調和諸藥。

近年來大量的實驗研究證實，長期服用中藥湯劑，能改善胃黏膜病變，從而改善慢性萎縮性胃炎癥狀[13-15]。本研究中的活源方作為一個新型藥方，可健脾和胃、調氣養陰、化瘀解毒，藥物配伍嚴謹、科學。本研究結果顯示，經治療后，活源方各治療組血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達均有下降，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。表明活源方可促進胃黏膜損傷恢復，對治療慢性萎縮性胃炎有良好的療效。