菠菜子水提取物的抗炎活性及急性毒性實驗研究

劉鴻雁，李 波*，郝寶成，姜專基，劉 淵，梁 云

(1.蘭州市肺科醫院，甘肅 蘭州 730000；2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050)

菠菜來源于藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL.，又稱菠薐，既作蔬菜用，又可入藥，其入藥始載于《食療本草》，屬藥食同源類植物，具有利五臟、通腸胃熱、解酒毒功效[1-2]。菠菜子是菠菜的果實，又稱菠薐菜子，具有清肝明目、止咳平喘之效，主治風火目赤腫痛、咳喘[3-4]。藥理研究表明菠菜提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗高血脂和降糖等活性[4-5]。菠菜在我國作為蔬菜有著悠久的栽培和食用歷史，在長期的食用過程中發現菠菜和菠菜子具有藥用屬性，菠菜和菠菜子作為蔬菜國內外已有大量研究，作為藥用，古代本草學對其功效和使用方法等亦有大量記載，但對其現代藥學的系統性研究較少，尤其是菠菜子屬于民間習用藥材，其藥理作用雖有一定研究基礎，但不夠系統和深入，導致其藥用資源開發和臨床應用受限。目前，隨著對菠菜子藥食同源開發利用的增多，應對其作用機理及藥效進行研究，為菠菜子的臨床合理應用和藥材資源開發提供實驗依據[6]。

中藥作為我國傳統醫學的重要組成部分，有著悠久的應用和發展史。中藥材來源受地域和古代認識水平所限，同一藥材的基原、產地加工和藥用部位往往在不同時期有不同的變化。目前，隨著科技的發展和對中藥研究的深入，中藥的毒性越來越受到重視，近年來很多臨床實踐和研究發現，由于對中藥材基原、炮制加工等認識欠缺，造成臨床使用不當，導致中藥在臨床應用中不良反應事件頻發，對中藥的安全用藥和臨床使用造成很大影響。菠菜和菠菜子來源于同一植物的不同藥用部位[6]，菠菜子屬于古代傳統和民間習用藥材，故對其進行初步安全性研究，以期為菠菜子的安全性和臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

SPF級昆明小鼠：體重(20±2)g，雌雄各半，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001)。SPF級SD大鼠：體重(120±2)g，雄性，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001)。飼養環境：SPF級別。飼養方法：按組分籠飼養，小鼠每籠6只，自由進食進水；小鼠每籠5只，自由進食進水。

1.2 藥品和器材

電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，批號：20180411，精確度0.000 1 g)；一次性使用無菌注射器(2 mL，鎮江康利醫療器械有限公司生產許可證：蘇食藥監械生產許20010222號)；二甲苯(天津市百世化工有限公司，批號：50180715)；水合氯醛(鄭州市德眾化學試劑廠，批號：20190315)；二甲苯(鄭州市德眾化學試劑廠，批號：20190315)；阿司匹林腸溶片(石藥集團歐意藥業有限公司，批號：286190163)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：170794)；菠菜子水提取物(蘭州市肺科醫院提供)；打孔器；棉球。

2 試驗方法

2.1 對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響

取SPF級昆明小鼠60只，隨機分為溶媒對照組、阿司匹林組0.30 g/kg、菠菜子水提取物0.75、1.50、3.00 g/kg劑量組，每組12只，雌雄各半，各組均以20 mL/kg灌胃給藥，溶媒對照組給與等體積超純水，1次/d，連續6 d。末次給藥后45 min，各組小鼠于右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.05 mL，左耳不涂為對照。致炎后1 h頸椎脫臼處死小鼠，用直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，取耳片于分析天平稱重，按下式計算耳腫脹度及抑制率：

腫脹度(mg)=右耳片質量-左耳片質量

抑制率=(溶媒組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/溶媒組平均腫脹度×100%

2.2 對大鼠棉球肉芽腫的影響

取SPF級SD大鼠50只，雄性，隨機分為溶媒對照組、醋酸地塞米松0.15 mg/kg和菠菜子水提取物0.5、1.0和2.0 g/kg劑量組，每組10只。用3.5%的水合氯醛麻醉，頸部剃毛，將2個高溫滅菌的棉球約75 mg植入大鼠雙側腋窩皮下，手術線縫合皮膚，注射氨芐青霉素1 mg/0.1 mL抗感染。各組大鼠于手術后第2天以10 mL/kg體重給藥劑量灌胃給藥，1次/d，連續9 d。末次給藥后1 h，頸椎脫臼處死小鼠，取出棉球，將棉球放入60 ℃烘箱中干燥12 h，稱重，減去原棉球質量即為肉芽凈重。

由于所形成的肉芽組織易向棉球纖維內浸潤，在剝離肉芽腫組織時應小心，否則影響其準確性。由于棉球的表面積對實驗結果的影響較大，為了減少差異，植入每只大鼠的棉球形狀和植入部位應相似。

2.3 菠菜子水提取物急性毒性試驗

2.3.1 預實驗 取昆明小鼠40只，隨機分為溶媒對照組和菠菜子水提取物(最大耐受量組以4的倍數共計設置4組：20 000 mg/kg、5 000 mg/kg、1 250 mg/kg、312.5 mg/kg)，每組8只，雌雄各半，連續觀察7 d，詳細記錄動物毒性反應情況和死亡情況，計算半數致死量(LD50)的置信區間。

2.3.2 最大耐受量試驗 取昆明小鼠40只，隨機分為溶媒對照組和菠菜子水提取物最大耐受量(20 000 mg/kg，濃度1 g/mL)，每組20只，雌雄各半。各組均以0.4 mL/20 g灌胃給藥，給藥后2 h、4 h連續觀察小鼠有無毒性反應及死亡情況，連續觀察7 d，主要觀察小鼠飲食、外觀、行為活動、分泌物、排泄物等是否有異常，死亡情況，中毒反應癥狀及起始時間、嚴重程度、持續時間、是否可逆及恢復時間等。分別于0 d、7 d稱重。實驗結束后，頸椎脫臼處死存活小鼠，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器有無異常及明顯病變。

3 結果與分析

3.1 統計學分析

用SPSS21.0統計軟件進行處理，數據用(均數±標準差)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時用LSD檢驗，兩兩比較方差不齊時用Tamhane檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3.2 對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響

本實驗結果顯示，菠菜子水提取物能抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，抑制率分別為低劑量組25.62%，中劑量組7.17%，高劑量組48.10%。菠菜子水提取物低劑量組和中劑量組與溶媒對照組相比較無統計學意義，且各劑量組未表現出劑量依賴性，其中，菠菜子水提取物高劑量組與溶媒對照組相比較有統計學意義(P<0.05)，提示菠菜子水提取物高劑量組具有抗炎、消腫作用，其抗炎機制需進一步研究。與阿司匹林陽性組比較，菠菜子水提取物各劑量組均無統計學意義(P>0.05)，提示菠菜子水提取物各劑量組的抗炎消腫作用與陽性藥阿司匹林組相當，見表1。

組別n劑量(g/kg)腫脹度(mg)抑制率(%)溶媒對照組12-7.6750±2.83681-阿司匹林陽性組120.306.1417±2.5393119.90菠菜子低劑量組120.755.7083±3.5287025.62菠菜子中劑量組121.507.1250±2.412897.17菠菜子高劑量組123.003.9833±2.07050?48.10

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05。

3.3 對大鼠棉球肉芽腫的影響

直觀分析發現：各劑量組對大鼠棉球肉芽腫的影響為高劑量組>中劑量組>低劑量組，但各劑量組比較無統計學意義(P>0.05)。菠菜子水提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組與溶媒對照組比較無統計學意義(P>0.05)，且各劑量組未表現出劑量依賴性。與醋酸地塞米松陽性組比較，菠菜子水提取物各劑量組的抑制作用相當(P>0.05)，見表2。

組別n劑量(mg/kg)肉芽比率(%)溶媒對照組10-2.9258±2.1674醋酸地塞米松陽性組100.152.5012±1.600菠菜子水提取物低劑量組105003.5010±1.1282菠菜子水提取物中劑量組1010002.5401±1.7836菠菜子水提取物高劑量組1020002.3489±0.8656

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05。

3.4 菠菜子水提取物急性毒性預試驗

實驗期內各劑量組小鼠無死亡發生，小鼠精神狀態良好，未觀察到明顯中毒現象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見明顯病變及異常。

通過對各組小鼠的體重變化情況進行分析，結果表明各組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見表3。

組別性別體重0d7d溶媒對照組♂20.73±0.8122.56±2.27♀21.49±0.4634.24±3.29312.5mg/kg組♂20.42±1.2923.92±1.27♀20.96±1.3933.27±1.621250mg/kg組♂21.09±0.2522.30±0.19♀21.33±0.7333.43±1.895000mg/kg組♂21.05±0.9624.11±2.24♀19.67±1.3432.75±2.7920000mg/kg組♂20.01±0.7222.64±0.73♀21.19±0.5634.04±2.16

3.5 最大耐受量試驗

實驗結果顯示：實驗期內各劑量組小鼠無死亡發生，小鼠精神狀態良好，未觀察到明顯中毒現象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見明顯病變及異常。

通過對兩組小鼠的體重變化情況進行分析，結果表明最大耐受組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見表4。

組別性別體重0d7d溶媒對照組♂21.18±0.9728.66±5.49♀21.45±0.3932.15±2.87最大耐受組♂21.02±0.6129.73±6.55♀21.41±0.5728.84±1.91

4 討論

本試驗依據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》[7]《中藥制劑的急性毒性試驗》[8]對菠菜子水提取物小鼠急性毒性進行了實驗研究，并對菠菜子水提物的安全性進行了初步評價。結果顯示：給藥組小鼠在各自劑量下均未出現明顯的中毒癥狀，也無死亡發生，尸檢未發現各臟器異常。給藥組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異。小鼠在20 000 mg/kg體重的劑量下沒有產生毒性作用，根據中藥毒性的分級標準可確定為實際無毒。本試驗未能測出該制劑的LD50，實驗結果顯示小鼠對菠菜子水提取物的最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)為20 000 mg/kg體重，且沒有產生毒性作用，根據中藥毒性的分級標準可認為菠菜子安全性較好，但由于本研究采用的是水提物，對于菠菜子中其他有效化學成分或有效部位的安全性還需做進一步系統研究。

炎癥是機體受到外傷、感染等損傷因子的刺激產生的一種以防御為主，損傷與抗損傷并存的基本病理過程。炎癥通常會改變機體的正常生理指標，誘發多種急、慢性炎癥疾病，并使含血管系統的生物機體產生復制的防御反應，炎癥是一種病理過程，早期(急性炎癥)主要表現為毛細血管擴張、通透性亢進、滲出和水腫，中期表現為血小板吸附及白細胞游走，晚期為肉芽組織增生。二甲苯所致小鼠耳廓腫脹是研究急性炎癥常用的模型，而大鼠棉球肉芽腫實驗是研究慢性炎癥常用的模型。本實驗從不同炎癥發展的不同階段選取了兩種模型進行研究。

本研究發現，兩種抗炎模型中隨著藥物濃度增加，藥效未相應增加，說明藥物效應達到飽和的程度后，再繼續增加藥物濃度，其效應不會再增加，即菠菜子水提取物可能是一種時間依賴性的物質，決定療效的重要因素取決于時間。綜上，菠菜子水提取物具有良好的抗炎活性且安全無毒，在防治急慢性炎癥、腹腔感染性疾病等方面具有很大的開發價值。目前，菠菜子的應用受限，今后應系統研究其安全性和有效性，需從多途徑多通路入手，包括HPAA系統、花生四烯酸代謝系統、炎癥因子、抗血栓、氧自由基清除等方面，在分子水平上探討其抗炎作用機制，為菠菜子的臨床合理應用及資源開發提供依據。