附子不同炮制品對陽虛小鼠免疫功能的影響

沈玉巧，林 華*，鄧廣海，陳丹丹，劉瑤玉，周 威

(1.廣東省中醫院 藥學部，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510380)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品，具有回陽救逆、散寒止痛之功效[1]。附子中的主要化學成分為生物堿，此外還含有多糖、黃酮類、皂苷類、植物甾醇等。其中附子多糖不僅能增強細胞免疫還能增強體液免疫，在抗腫瘤、抗氧化等方面均有較好的作用[2]。附子的傳統炮制工藝往往以減毒為主，因此常有炮制品的毒性雖然很小，但有效成分含量偏低的現象[2]，發揮不了功效。本實驗對比了高溫、高壓、微波三種新型炮制工藝，結合傳統炮制工藝，對炮制品煎煮液的6種主要單雙酯型生物堿含量進行了測定[1]，同時對4種炮制品對于陽虛小鼠免疫器官的影響進行比較，為附子新型炮制工藝的推廣與應用提供藥理學基礎。

1 材料與設備

1.1 動物

實驗所用動物均為SPF級 KM種小鼠，雌、雄各半，體質量約20 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供(小鼠合格證號：44007200012065)。

1.2 儀器與試藥

AUY220型分析天平(日本島津)、Agilent-1200型HPLC、RV 10basic V旋轉蒸發儀(IKA)。附子藥材(批號：20130812，產地：四川江油)由康美藥業四川江油分公司提供，經廣東省中醫院藥劑科主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根；微波炮制品、黑順片、高溫炮制品、高壓炮制品均由實驗室按照統一標準條件通過同一批原藥材制得。乙腈、四氫呋喃為色譜級純；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(批號：201308011，煙臺北方制藥有限公司)；水合氯醛為分析純。

2 方法

2.1 炮制工藝

2.1.1 黑順片[1]按照藥典要求進行炮制。

2.1.2 高壓炮制片[4]取附子生品2 kg，洗凈后噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布悶潤30 min，設置壓力為0.1 MPa蒸制150 min，切薄片于50 ℃烘干去除碎屑即得。

2.1.3 高溫烘制片[5]取附子生品2 kg，每天按時更換膽巴水，泡至內無白心，切薄片于烘箱120 ℃烘制12 h，去除碎屑即得。

2.1.4 微波炮制片[6]取附子生品2 kg，噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布至透心，切薄片放入格蘭仕微波爐中，中火炮制25 min即得。

2.2 煎煮液的制備及含量測定

取附子各炮制品1 000 g加入陶瓷煎鍋中，先加10倍量水浸泡30 min后，武火至沸，再文火煎煮1 h，過濾，藥渣加8倍量的水煮沸后再煎煮30 min，合并2次煎煮液。真空減壓加熱濃縮至0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg；置于冰箱冷藏室保存。取煎煮液各10 mL，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置橢圓形旋轉燒瓶中，40 ℃減壓回收溶劑至干，向瓶中加入鹽酸-甲醇(0.05%)溶液2 mL溶解，過0.45 μm微孔濾膜即得。通過HPLC測得生品及炮制品以及炮制品煎煮液的生物堿含量。

2.3 對陽虛小鼠免疫器官的影響

取合格的SPF級KM小鼠，雌雄各半，隨機分為模型組、空白組、4種炮制品組(包括0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg三種濃度)，共14組，每組8只。參照文獻方法[7]，模型組及各給藥組小鼠每日灌胃給予氫化可的松琥珀酸鈉溶液1 mg/只/天，空白組小鼠每日給予同體積生理鹽水，連續造模9天。第10天開始，空白組和模型組灌胃給予蒸餾水0.2 mL/10 g，給藥組按照附子不同炮制品給藥劑量0.2 mL/10g進行灌胃給藥，連續給藥6天。于第11、13、15天灌胃給藥后，給藥組及模型組繼續給予造模給藥。于第1、5、9、10、12、15天對各組小鼠進行稱重。末次給藥后24 h，斷頭處死。立即取各組小鼠的脾臟、胸腺，0.9%的生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后稱重，計算脾臟、胸腺的質量指數。

2.4 結果統計

實驗數據使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

3 結果

3.1 附子生品及不同炮制品生物堿含量

測得附子生品和4種炮制品以及4種炮制品煎煮液的主要生物堿含量見表1、表2。由表1及表2可知，附子高壓炮制品及其煎煮液的單酯型生物堿含量最高，雙酯型生物堿含量最低；炮制品生物堿含量均在2015版藥典的限量范圍內。

表1 附子生品及不同炮制品生物堿含量 (mg/g)

注：“-”代表未檢出，計算時按“0.000 0”計。

表2 附子不同炮制品煎煮液的生物堿含量 (mg/g)

注：“-”代表未檢出，計算時按“0.000 0”計。

3.2 各組小鼠體質量隨時間變化趨勢

通過SPSS 20.0軟件統計分析發現，造模9天后模型組及各給藥組小鼠體質量與空白組小鼠體質量比較存在統計學差異(P<0.05)，說明本次實驗造模是成功的。由圖1、圖2、圖3四種炮制品的高、中、低三種給藥濃度的體質量增長趨勢圖可知，4種給藥組小鼠體質量增加幅度均較模型組變大，但無明顯差異(P>0.05)；同時高壓片組的體質量增長幅度略高于其他3組。

圖1 小鼠體質量變化趨勢(0.75 g/kg劑量組)

圖2 小鼠體質量變化趨勢(1.50 g/kg劑量組)

圖3 小鼠體質量變化趨勢(4.50 g/kg劑量組)

3.3 附子不同炮制品對陽虛小鼠免疫器官的影響

組別劑量(g/kg)胸腺指數(mg/g)脾臟指數(mg/g)空白-3.7189±1.3568?2.2194±0.2807?模型-1.5649±0.16341.2653±0.1351高溫片組高壓片組微波片組黑順片組高溫片組高壓片組微波片組黑順片組高溫片組高壓片組微波片組黑順片組0.751.504.501.9269±0.40661.9238±0.35111.7130±0.18992.1016±0.48972.3211±0.4929?2.2242±0.2788?1.9044±0.13612.3065±0.5675?2.6364±0.6458?2.8701±0.9905?2.3092±0.5118?2.7738±1.0111?1.3424±0.07221.3613±0.19581.3111±0.10511.3940±0.18761.4509±0.0503?1.5083±0.1611?1.4967±0.1626?1.4567±0.1848?1.6448±0.1719?1.7345±0.1511?1.6188±0.1518?1.6679±0.2329?

由表3可知，模型組與空白組相比，小鼠的胸腺及脾臟指數出現較大幅度的下降(P<0.05)；與模型組相比，隨著給藥濃度的增加，附子4種炮制品組脾臟指數及胸腺指數較模型組均有所增加。同時在給藥濃度為4.50 g/kg時，各炮制品組與模型組相比存在顯著性差異(P<0.05)，說明附子炮制品均能提高陽虛小鼠的免疫器官質量指數；且隨著給藥濃度的增加，對免疫功能的提高作用成正相關，臟器指數的增加能夠反映免疫功能的提高[8]。附子4種炮制品組在相同給藥濃度的條件下，對陽虛小鼠免疫器官質量指數的提高無統計學差異(P>0.05)。

4 討論

附子傳統的炮制工藝為了降低毒副作用，首先要通過長時間的膽巴水浸泡、再通過蒸煮等方法進行炮制加工，毒副作用降低的同時生物堿類成分損失嚴重，而且炮制過程復雜耗時。本文通過對高溫烘制、高壓蒸制、微波炮制與傳統炮制的附子進行比較研究，發現高壓蒸制片的生物堿能夠得到較好的保存，同時對陽虛小鼠的體質量及免疫功能的提高也較好。至于高壓蒸制工藝能否取代傳統炮制工藝還需進一步的實驗支持與完善。