薏苡附子敗醬散治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制*

★ 周步高 劉馥春 張曉云 劉端勇 趙海梅*（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院 南昌 330004）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種非特異性炎癥性腸病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，在中醫(yī)學(xué)上可歸屬為“腸癖”“泄瀉”“痢疾”范疇，但結(jié)合UC腸黏膜損傷的病理特征，則與“腸癰”更為接近［1-2］，尤其是重度UC。曹穎甫［3］將膿成描述為：《金匱》所謂未成已成之膿所包至廣，一切炎性滲出物、腐化之白血球、腐爛之腸壁皮肉等均是，要在當(dāng)去之例一也。《諸病源候論》曰：“大便膿血，似赤白下痢，而實(shí)非者，

是腸癰也，卒得腸癰不曉，治之錯(cuò)在殺人。”由此可知腸癰與UC的相似性。薏苡附子敗醬散（YFBP）

出自于仲景張機(jī)的《金匱要略》，用于治療膿成之腸癰。臨床上，YFBP治療UC的有效性也有相關(guān)報(bào)道［4-5］。實(shí)驗(yàn)研究表明，YFBP可增強(qiáng)UC小鼠抗氧化應(yīng)激能力［6］，調(diào)節(jié) Claudin蛋白的表達(dá)［7］，也可通過恢復(fù)Treg/Th17平衡來達(dá)到改善UC的目的［8］。

但是，YFBP治療UC的有效成分以及作用機(jī)制仍然顯得模糊不清。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)YFBP治療UC的有效成分以及作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析，為下一步的深入研究提供參考。

1 方法

1.1 薏苡附子敗醬散有效成分的篩選分別以“薏苡仁”“附子”“敗醬草”為檢索詞，OB（生物利用度）≥ 30%，DL（類藥性）≥ 0.18，MW（相對(duì)分子質(zhì)量）＜ 500為過濾條件［9］，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出三味中藥的有效成分。

1.2 有效成分藥物靶點(diǎn)的收集根據(jù)上一步篩選出的有效成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取其藥物靶點(diǎn)，對(duì)沒有藥物靶點(diǎn)信息的有效成分給予剔除，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（ http ：//www.uniprot.org /uploadlists/）獲取藥物靶點(diǎn)蛋白的基因名（Gene cards）。

1.3 UC基因靶點(diǎn)的收集以“Ulcerative Colitis”為關(guān)鍵詞，從Geencard數(shù)據(jù)庫中獲取UC的Gene Symbol，結(jié)果保存在Excel中。

1.4 求藥物靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)的交集運(yùn)行R語言，得到藥物靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)的重疊部分。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析將薏苡附子敗醬散活性成分的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“homo sapiens（人類）”，獲得蛋白互作關(guān)系，結(jié)果以TSV格式保存，對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)）的度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 KEGG通路富集分析應(yīng)用R語言3.5.3加載 chusterprofiler［10］包，對(duì) YFBP作用于 UC 的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)行KEGG分析，設(shè)定P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 有效成分與靶點(diǎn)根據(jù)“1.1”初步收集到薏苡仁、附子、敗醬草的有效成分分別有8個(gè)、14個(gè)、11個(gè)，其中，sitosterol為三味中藥所共有，Stigmasterol為薏苡仁和敗醬草所共有，故有30個(gè)候選的有效成分。但是，在這30個(gè)化合物中，有10個(gè)化合物未檢索到其藥物靶點(diǎn)信息，故給予剔除。從Geencard數(shù)據(jù)庫中獲得3738個(gè)UC靶點(diǎn)。最后，求藥物靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)的交集，結(jié)果有18個(gè)有效成分的122個(gè)靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)重疊，如表1和圖1-2所示。

表1 附子薏苡敗醬散活性成分基本信息

圖1 中藥-化合物網(wǎng)絡(luò)

圖2 化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析如圖3所示，縱坐標(biāo)為靶點(diǎn)名稱，橫坐標(biāo)為度值，其中，度值排名前七的靶點(diǎn)有絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、JUN、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生長因子受體（EGFR）等。

圖3 靶點(diǎn)信息條形圖

2.3 KEGG通路分析如圖4所示，橫軸表示該信號(hào)通路的靶基因個(gè)數(shù)，縱軸是對(duì)通路的描述，顏色表示P值大小。YFBP作用于UC的相關(guān)靶點(diǎn)主要富集于PI3K-Akt信號(hào)通路、乙肝信號(hào)通路、巨細(xì)胞病毒性感染通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣化等，本研究主要對(duì)靶基因富集最多的PI3K/Akt信號(hào)通路和P值最小的AGERAGE信號(hào)通路進(jìn)行分析。

圖4 靶基因富集通路信號(hào)通路

3 討論

YFBP作為治療腸癰的經(jīng)典配方，在UC的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)研究中的改善作用是已知的。中藥復(fù)方化學(xué)成分與靶點(diǎn)的多樣性，使其治療疾病的有效成分和內(nèi)在機(jī)制難以揭示、難以可視化。在本研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)盡可能最大化地預(yù)測(cè)和展示了YFBP治療UC的潛在化合物和靶標(biāo)。

YFBP的化學(xué)成分經(jīng)過層層篩選與剔除后，最終獲得治療UC的18種有效成分，其中，潛在靶標(biāo)最多的是槲皮素（quercetin），高達(dá)99個(gè)，其次為木樨草素（luteolin），41個(gè)靶標(biāo)。近年來，國內(nèi)外已開展了不少槲皮素、木樨草素治療UC的相關(guān)研究，其內(nèi)在機(jī)制也得到了不同程度的揭示。如槲皮素可通過調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞的平衡來增強(qiáng)腸道的抗炎、抗菌作用［11］，可抑制NF-κB的激活和iNOS的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［12］；木樨草素可通過激活Nrf2信號(hào)通路來增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)性UC的抗氧化能力［13］。但是，根據(jù)本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果，它們的內(nèi)在機(jī)制遠(yuǎn)不于此，因此還有很大的探索空間。

PPI網(wǎng)絡(luò)是對(duì)靶蛋白與靶蛋白之間的相互作用力的強(qiáng)度進(jìn)行分析的一種方式，靶蛋白的度值越高，即該靶蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要性越強(qiáng)。在本研究中，度值前三名的靶蛋白分別是Akt1，IL6和VEGFA。Akt1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，對(duì)eNOS的誘導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞的功能至關(guān)重要，對(duì)巨噬細(xì)胞的極化也起著重要的調(diào)節(jié)作用，Akt1的敲除可加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎［14］。IL-6是一種致炎因子，主要來源于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞，其基因的表達(dá)水平在活動(dòng)性UC患者中是顯著增加的［15］。VEGF-A是一種促血管生成因子，過量的表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致病理性血管的生成和白細(xì)胞的募集，使腸粘膜炎癥加重［16］。以上靶點(diǎn)在UC中所扮演的角色和在PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)重要性提示，它們很可能是YFBP治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。

本研究主要對(duì)靶基因富集最多的PI3K/Akt信號(hào)通路和P值最小的AGE-RAGE信號(hào)通路進(jìn)行闡述。磷酸肌醇3-激酶［17］（PI3K）廣泛地參與了細(xì)胞的生長、代謝和增殖等生物學(xué)活動(dòng)；Akt［18］是PI3K的下游效應(yīng)器，可由PI3K、炎癥、DNA損傷等因素激活。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路密切參與了TNF-α等促炎因子的調(diào)控和釋放，是UC的重要發(fā)病機(jī)制之一［19］。同時(shí)，干預(yù)該條信號(hào)通路也是諸多藥物有效治療UC的相關(guān)機(jī)制，如四神丸［20］、氧化苦參堿［21］、美沙拉嗪［22］等。28 個(gè)靶蛋白基因富集在PI3K/Akt信號(hào)通路，由此可推測(cè)該條通路對(duì)YFBP改善UC的重要性。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）是免疫球蛋白超家族的跨膜受體，可識(shí)別包括晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs在內(nèi)的多種配體［23］。RAGE的刺激導(dǎo)致NF-κB的激活和易位，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放與氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而引起炎癥反應(yīng)［24］。目前，促炎性AGERAGE信號(hào)通路與UC的關(guān)系研究較少。但已有研究表明，UC患者腸粘膜炎癥部位的RAGE的表達(dá)水平顯著高于非炎癥部位［25］。由此可見，干預(yù)該條通路也可能是治療UC的潛在策略之一。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是對(duì)現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)的整合利用和再分析，在一定程度上可提高實(shí)驗(yàn)研究的針對(duì)性。本研究預(yù)測(cè)了YFBP的到18個(gè)治療UC的潛在有效成分，122個(gè)可能靶點(diǎn)、144條信號(hào)通路，并擇取其中幾個(gè)研究價(jià)值較大的成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路進(jìn)行了分析。如槲皮素的靶點(diǎn)數(shù)達(dá)到99個(gè)；Akt1節(jié)點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的度值高達(dá)99，這充分暗示了其研究價(jià)值所在。因此，值得通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。