調(diào)脂通脈解毒方對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及腦梗死體積的影響

孫琛琛，方曉磊*，楊惠民，劉福生，劉陟，崔瑞剛，吳笛，劉重琪，李中康

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

腦梗死是我國的常見病和多發(fā)病，急性腦梗死發(fā)病率約為12.5%，其致殘率、致死率均較高[1]，給社會(huì)和家庭帶來了極大的負(fù)擔(dān)，卒中后大多伴精神狀態(tài)的改變，給患者身心帶來極大的傷害[2]。腦梗死的過程是腦動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)膜受損在局部形成血栓，使動(dòng)脈管腔狹窄，進(jìn)而閉塞血管，使腦組織缺血缺氧而壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，給社會(huì)和家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[3]。腦缺血再灌注損傷過程是自由基因缺血、缺氧一段時(shí)間后血液重新供應(yīng)而過量釋放，從而攻擊腦組織細(xì)胞，主要集中在重新獲得血液供應(yīng)的腦組織細(xì)胞[4]。其過程是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括諸多環(huán)節(jié)，如炎性細(xì)胞浸潤[5]、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞水腫[6]、自由基生成等，因此要減輕腦缺血再灌注損傷，控制炎癥反應(yīng)是關(guān)鍵[7]，調(diào)脂通脈解毒方是由調(diào)脂通脈顆粒演變而來，具有益氣活血化痰解毒的作用。本課題利用線栓法形成大鼠腦缺血再灌注損傷模型，研究調(diào)脂通脈解毒方對腦缺血損傷大鼠hs-CRP、Lp-PLA2炎癥因子影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用；并應(yīng)用TTC染色法對大鼠的大腦進(jìn)行染色，觀察大鼠大腦梗死體積，從而探討調(diào)脂通脈解毒方對于腦缺血腦梗死體積的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)(SPF級(jí))SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào):SCXK(京)2016-0006。本實(shí)驗(yàn)符合中國倫理委員會(huì)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，經(jīng)過本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(201814)。

1.2 藥物與試劑

調(diào)脂通脈解毒方：以益氣活血化痰、通脈解毒為原則，由太子參、黃芪、丹參、半夏、草決明、土茯苓等組成。本實(shí)驗(yàn)采用北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室制作的顆粒劑，批準(zhǔn)文號(hào):(98)京衛(wèi)藥制字〔052〕第F-1266號(hào)。

尼莫地平(天津中央藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15150044，30 mg/片)；大鼠hs-CRP、Lp-PLA2 ELISA試劑盒(北京歐北生物科技有限公司，批號(hào)：20150128)；氯化三苯基四氮唑(TTC染色液)(美國Sigma公司)；3600AAA 尼龍線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器

Max-M5酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，1510)。

1.4 造模與分組

1.4.1 造模

1)稱重并麻醉：用電子秤稱重并記錄，應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.35 mL/100 g，然后放入提前備好的鼠籠。

2)采用MCAO法造模，即大腦中動(dòng)脈閉塞法。用分離器分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，然后用動(dòng)脈夾子夾閉右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，用眼科剪在右側(cè)頸總動(dòng)脈血管剪一小口，將線栓插入至大腦中動(dòng)脈起始端，2 h后，將線栓抽出并結(jié)扎開口，實(shí)現(xiàn)再灌注缺血再灌注，假手術(shù)組不插入線栓[8]。

3)評分：應(yīng)用Zea-Longa的評分方法[9]進(jìn)行神經(jīng)功能評分，五級(jí)四分法，評分≥2分的的大鼠為造模成功，可以用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組

隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、調(diào)脂通脈解毒方低劑量組、調(diào)脂通脈解毒方中劑量組、調(diào)脂通脈解毒方高劑量組、尼莫地平組。每組20只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥

假手術(shù)組給予等體積溶媒；模型組給予等體積溶媒；調(diào)脂通脈解毒方低劑量組給予20 mg/(kg·d)調(diào)脂通脈解毒方；調(diào)脂通脈解毒方中劑量組給予40 mg/(kg·d)調(diào)脂通脈解毒方；調(diào)脂通脈解毒方高劑量組給予60 mg/(kg·d)調(diào)脂通脈解毒方；尼莫地平組給予15 mg/(kg·d)尼莫地平。給藥時(shí)間為術(shù)后14 d，灌胃給藥，每天1次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 腦組織生化指標(biāo)檢測

將各組大鼠隨機(jī)取7只大鼠麻醉后斷頭取腦；準(zhǔn)確稱取部分腦組織后，按照1:9加入預(yù)冷至4 ℃的生理鹽水，勻漿后取上清，分裝、凍存。按照試劑盒說明書中的操作，采用放射免疫法測定hs-CRP及Lp-PLA2含量。

1.6.2 大鼠大腦TTC染色

1)切片：灌胃2周后，在不同時(shí)間點(diǎn)每組大鼠取3只立即斷頭取腦，20 ℃冰箱中速凍20 min左右,便于切片。

2)避光溫育：將腦切片置于2%、37 ℃的TTC溶液中，避光溫育30 min。

3)固定：多聚甲醛中固定(PBS配置，濃度1%)。

4)計(jì)算面積：觀察大鼠顱腦切片，取最大層面，掃描照片，應(yīng)用Lcica圖像處理系統(tǒng)測定腦梗死面積，利用公式計(jì)算體積和百分比(梗死體積/對側(cè)腦片體積×100%)，表示損傷程度[10]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PLA2表達(dá)情況比較

結(jié)果見表1和圖1、圖2。與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、調(diào)脂通脈解毒方各組大鼠腦組織hs-CRP、Lp-PLA2含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，調(diào)脂通脈解毒方各組、尼莫地平組hs-CRP、Lp-PLA2含量均顯著降低(P<0.01)。

表1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PLA2表達(dá)情況比較

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

圖1 各組大鼠hs-CRP含量比較

圖2 各組大鼠Lp-PLA2含量比較

2.2 各組大鼠TTC染色的結(jié)果

結(jié)果圖3和表2。除假手術(shù)組外其余各組均出現(xiàn)腦梗死情況，與模型組比較，調(diào)脂通脈方高、中、低劑量組和民莫地平組均能顯著改善腦梗死情況，其中以高劑量組最優(yōu)。

表2 各組大鼠腦梗死體積及百分比情況比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

腦缺血造成的血液循環(huán)障礙會(huì)使腦組織在缺血、缺氧的情況下誘發(fā)無氧酵解，發(fā)生時(shí)出現(xiàn)局部微循環(huán)障礙，造成腦組織缺血、缺氧從而引發(fā)無氧糖酵解，產(chǎn)生大量的乳酸、炎癥因子等炎癥介質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡[11]。

圖3 各組大鼠TTC染色的結(jié)果

恢復(fù)腦血流是緩解和避免腦損害的方法,但腦缺血再灌注卻能引起腦損傷，腦缺血再灌注損傷的病理和生理過程復(fù)雜，有很多學(xué)說，其中炎癥反應(yīng)是重要的一環(huán)是許多專家的共識(shí)[12]。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷最重要的部分，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)[13]是目前檢測機(jī)體炎癥反應(yīng)最敏感的指標(biāo)，hs-CRP是高敏反應(yīng)蛋白，與人們所熟悉的CRP關(guān)系密切，是一種細(xì)胞因子，也是最近比較熱點(diǎn)的炎癥因子[14]。有研究表明,hs-CRP 可以透過血腦屏障，直接進(jìn)入腦脊液，成為腦組織損傷的重要標(biāo)志物，對于評估急性腦梗死病灶大小、病情及預(yù)后具有參考價(jià)值，hs-CRP激活補(bǔ)體成分是通過各種途徑實(shí)現(xiàn)的，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管緊張性[15]；同時(shí)可以激活纖溶系統(tǒng)，增強(qiáng)血小板聚集，上調(diào)內(nèi)皮黏附因子，激活靜止的內(nèi)皮細(xì)胞，從而引起血栓形成[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中假手術(shù)組的hs-CRP含量最低，模型組的含量最高，尼莫地平組的含量小于調(diào)脂通脈顆粒組，考慮到觀察時(shí)間較短，不能很好地反應(yīng)調(diào)脂通脈顆粒的長期預(yù)后;且調(diào)脂通脈組高劑量的hs-CRP含量低于中劑量組和低劑量組，說明高劑量組在抗炎效果方面優(yōu)于中、低劑量組，可見高劑量組能較好地抑制炎癥因子的釋放。

脂蛋白相關(guān)磷脂酶(Lp-PLA2)是新型炎癥指標(biāo)，其別名是血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH)，分子量為45 kDa，參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和最終破裂的全過程，Lp-PLA2是T細(xì)胞分泌的，且此細(xì)胞只存在于血管內(nèi)壁，Lp-PLA2高表達(dá)時(shí)說明了血管的炎癥反應(yīng)活躍[17]。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的血管中，因自發(fā)地啟動(dòng)了ox-LDL的水解程序，脂質(zhì)類促炎增多，加重AS的進(jìn)展[18]。AS斑塊和Lp-PLA2相互影響，腦梗死會(huì)刺激巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌Lp-PLA2[19]，有研究表明Lp-PLA2可以作為腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明調(diào)脂通脈的抗炎作用與濃度有關(guān)，高劑量組的抗炎效果最好，模型組因未應(yīng)用藥物干預(yù)，Lp-PLA2的含量最高。模型組梗死體積最小，高劑量組次之，高劑量組的療效優(yōu)于中、低劑量組，說明其療效與劑量相關(guān)。

腦梗死[21]見于“中風(fēng)”“卒中”描述中，老年人多見，主要是由于老年人多年老體弱，正氣不足，臟腑之氣漸衰，精氣漸減，脾氣虛弱，無力健運(yùn)水谷，積聚成痰濕，阻礙氣血運(yùn)行，留為瘀血，痰瘀互阻，阻滯腦絡(luò)，發(fā)為中風(fēng)[22]。在《靈樞·刺節(jié)真邪》篇中言：“虛邪偏客于身半，其人深，內(nèi)居營衛(wèi)，營衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨(dú)留，發(fā)為偏枯”，認(rèn)為正虛邪盛是其發(fā)病的主要病機(jī)[23-24]。而調(diào)脂通脈解毒方就是針對氣虛痰瘀阻滯之缺血性腦卒中而設(shè),以太子參、黃芪健脾益氣，丹參、赤芍活血化瘀；佐以草決明、半夏燥濕化痰；澤瀉利水祛痰；山楂消痰去積、活血祛瘀，全方益氣活血化痰，使氣虛得補(bǔ)，氣血得運(yùn)，血瘀得通，痰濁得化。臨床研究表明，在益氣化痰活血法指導(dǎo)下組方的調(diào)脂通脈顆粒，具有降低血脂異常患者血脂水平和改善患者血液流變性、改善血液黏、濃、聚、凝狀態(tài)及凝血和纖溶系統(tǒng)功能的作用，具有一定的抗凝血、防止血栓形成、抗動(dòng)脈硬化的功效[25]。調(diào)脂通脈解毒方在調(diào)脂通脈顆粒的基礎(chǔ)上增加了土茯苓等解毒的藥物，久病成瘀，久病成毒，符合王永炎院士提出“毒損腦絡(luò)”的理論[26]，加用解毒清熱的中藥，增強(qiáng)其解毒的作用。

綜上所述，調(diào)脂通脈解毒方可以減輕腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血再灌注損傷，但效果在2周內(nèi)不如尼莫地平明顯，考慮可能為實(shí)驗(yàn)周期不夠的原因，應(yīng)加大樣本量和觀察周期。