內服外用對口腔黏膜潰瘍大鼠模型作用及其對炎性介質的影響

王振國，董秀華，賈穎

(成都醫學院第一附屬醫院，四川 成都 610500)

口腔潰瘍屬“口瘡”“口糜”“口疳”等證范疇[1]，指以周期性反復發作為特點的口腔黏膜局限性潰瘍性損害，多為圓形或橢圓形，有明顯的灼痛，一般于7～10日自行愈合，但該病反復發作，愈合欠佳，具有自限性、周期性等特點，給患者生活帶來嚴重困擾，影響患者生活質量[2]。目前，臨床上大多采用減輕緩解疼痛的原則進行干預，并以預防復發為主。中醫臨床治療口腔潰瘍提倡內外聯用，臨床常用的外用口腔潰瘍中成藥有冰硼散、錫類散、養陰生肌散等[3]?；诖耍緦嶒炓员鹕⑼庥寐摵蟽确S瀉心湯為基礎，探討內服外用對口腔潰瘍(RAU)模型大鼠的治療作用并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠50只，體質量180 g～220 g，雌雄不限。購自成都達碩實驗動物有限公司中心，合格證號：SCXK(川)2014-028。大鼠飼養溫度(25±2)℃,相對濕度55%～70%，符合要求。

1.2 主要試劑與儀器

瀉心湯：主要成分為大黃、黃連、黃芩；冰硼散(洛陽寧竹藥業有限公司)；腫瘤生長因子α(TNF-α)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素10(IL-10)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、顯色劑DAB(南京建成生物工程有限公司)。

酶標定量測定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；多功能照相顯微鏡(日本Olympus)；離心機5415D(Eppendorf公司，德國)；超薄石蠟切片機(德國徠卡)。

1.3 潰瘍模型建立

50只SD大鼠，適應性喂養后，隨機分為正常組(A)、模型組(B)、冰硼散組(C)、三黃瀉心湯組(D)、冰硼散+三黃瀉心湯組(C+D)共5組，各組10只。正常組進行常規喂養，不予任何處理；B組、C組、D組、C+D組采用化學燒灼法建立口腔潰瘍動物模型。方法：將大鼠固定，以1%戊巴比妥鈉(0.025 g/kg)麻醉，以蘸有NaOH晶體的濾紙(直徑3 mm)在下唇靠口角黏膜處燒灼5 s～8 s，生理鹽水沖洗，1天后形成潰瘍。每只動物潰瘍面應盡量在同一部位，大小、深度盡量一致[4]。其中C組、C+D組，給予冰硼散以覆蓋創面為度，D組及C+D組在以1 g/kg灌胃2 mL三黃瀉心湯藥液，A組與B組采用相應體積生理鹽水灌胃，各組連續治療6 d。

每組10只大鼠，1只用于HE染色，剩余9只用于第6天ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-2、IL-10含量及其他課題組中涉及的考察指標。

1.4 潰瘍組織HE染色

給藥6天后，各組大鼠隨機選取1只采用頸部脫臼法處死，剪下潰瘍組織，面積為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm，將剪下的潰瘍組織用磷酸鹽緩沖液PBS反復沖洗，清洗完成后置入4%多聚甲醛固定，24 h后將固定的組織置入自動組織脫水機中進行梯度酒精脫水、然后以二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋等步驟；經組織切片(5 μm)、攤片、撈片、烤片后，脫蠟至水。蘇木精染色、鹽酸分化、再以流水沖洗，沖洗完成后用酒精脫水，使用伊紅溶液染色，使其上色便于拍照。最后再以梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片，最后置于多功能照相顯微鏡下觀察、拍照[1]。

1.5 潰瘍的形成及愈合情況

實驗期間，定期觀察并記錄潰瘍從發生至愈合的時間、潰瘍形狀及愈合狀態等，用游標卡尺測量潰瘍的直徑并計算其面積，直至給藥結束。

1.6 炎性介質的水平變化

給藥6天后，收集各組大鼠血清，采用考馬斯亮蘭法測定各炎性介質的水平。按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，反應終止后，在酶標儀設置450 nm波長，測量各孔的光密度(OD值)，檢測組織中炎性介質TNF-α、IL-2、IL-10含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色結果比較

A組大鼠正常飼養，其口腔黏膜組織上皮完整、連續，細胞排列整齊、有序，胞核胞漿無異型性。B組大鼠，造模后不予給要處理，可看到其口腔黏膜被破壞，細胞排列，不規則，潰瘍呈圓形或橢圓形，潰瘍組織周圍邊緣充血、紅腫，同時黏膜的表面覆有灰黃或灰白色膜。C組、D組、C+D組在造模后進行藥物干預，給藥6 d后，3組大鼠的潰瘍面積均呈縮小趨勢，同時有新生疤痕膜覆蓋，充血癥狀減輕，滲出物減少；聯合給藥(C+D組)的大鼠，潰瘍癥狀減輕程度大于C組或D組，并伴有部分新生肉芽產生。見圖1。

圖1 各組大鼠口腔黏膜組織病理染色(HE，×100)

2.2 各組潰瘍面積變化情況比較

具體數據如表1所示，與模型組比較，給藥第1天，各給藥組潰瘍面積均無明顯變化，從第2天起，各給藥組的口腔面積均較模型組有所減小，且隨時間逐漸好轉，到給藥第6天，各給藥組與模型組比較，口腔潰瘍面積均顯著縮小，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；但C組、D組之間無明顯差異，C+D組較C組或D組均有顯著改善，異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠潰瘍面積變化

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，￥P<0.05。

2.3 各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10含量比較

各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10水平的變化見表2。給藥后6 d，與空白組比較，模型組與各給藥組的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10含量均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組的炎性因子TNF-α、IL-2、IL-10水平顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)；其中，C+D組(內服+外用組)的炎性因子水平顯著低于C組/D組(內服或外用)(P<0.05)。

表2 各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10的水平變化

注：與空白組比較，☆☆P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，￥P<0.05。

3 討論

中醫學認為口腔潰瘍屬“口瘡”范疇，口瘡的產生主要是由外感邪熱、心脾積熱；或陰虛陽亢、虛陽浮越等造成的虛火上浮或邪熱上蒸導致[5-7]，病程纏綿難愈。三黃瀉心湯主要由大黃、黃連、黃芩組成，三者均具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。現代藥理研究顯示，黃連的主要成分(小檗堿型化合物)，在分子結構特點上均屬異喹啉類生物堿，具季銨基團。在抗炎方面，三黃瀉心湯具有較好的療效[8]。冰硼散，由玄明粉、硼砂、朱砂粉、冰片組成，具有清熱解毒、消腫止痛、祛腐生肌的作用，主治咽喉口齒新久腫痛及久嗽痰火，音啞咽痛，為口齒及喉科要藥[9]。內服外用使用能達到雙倍的功效，加快發揮消腫止痛、清熱收斂的功效，使潰瘍得治。口腔黏膜直接灼傷，熱邪日久損傷正氣，形成局部津液不足，臨床表現為口腔潰瘍、咽喉紅腫熱痛、口干等陰虛內熱之象?；诖耍菊n題以外用冰硼散與內服三黃瀉心湯聯用的方式進行實驗研究，探討其治療作用及部分抗炎機制。

炎性介質IL-2是輔助性T細胞所分泌的重要淋巴因子之一，IL-2已成為機體免疫系統中極為重要的抗腫瘤、抗感染、抗衰老介質[10]。研究顯示，IL-2可以促進T細胞增殖，增強T細胞活性，有調節免疫功能作用，調控組織修復過程，有益于創傷修復，促進口腔潰瘍愈合[11]。IL-2活性水平降低會導致免疫網絡中的某一環節或某些環節發生障礙，以致造成機體免疫功能異常而導致發病。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠IL-2活性水平明顯下降，各給藥組的IL-2水平均較模型組有所升高，表明口腔潰瘍大鼠輔助性T細胞功能低下，給藥后，功能增強，說明輔助性T細胞功能低下可能是口腔潰瘍發病的一個重要原因。

炎癥介質TNF-α和IL-10是參與口腔潰瘍形成過程中的具有代表性的主要炎癥細胞因子[12]，其水平高低與病情輕重密切相關，即潰瘍數目越多，潰瘍面積越大，TNF-α和IL-10含量越高[13]。炎性介質IL-10主要由單核-巨噬細胞產生，當機體受到外界刺激時，該介質具有廣泛的促炎作用。本研究結果表明，C組或D組以及C+D組均能顯著抑制炎性介質TNF-α、IL-10的水平；在不斷給藥過程中，潰瘍逐漸愈合，機體炎癥癥狀減輕炎性介質水平明顯降低，且聯合用藥的潰瘍愈合能力優于單獨外用或內服。

綜上所述，對于口腔潰瘍的治療，可選擇內服外用聯合用藥，對于減輕的癥狀，減少發病時間、有效抑制反復發作具有雙倍的作用。