地龍?zhí)崛∥锟狗卫w維化的有效成分分析

陳宏，張偉，郭建波，宋倩男，王偉明

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺纖維化是最常見的肺間質(zhì)疾病，也是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重的疾病之一[1]。隨著空氣污染日益嚴(yán)重，霧霾的頻發(fā)，發(fā)病率也正在逐步提高。肺纖維化目前治療藥物匱乏，患者的死亡率高,統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，肺纖維化患者的病死率要高于很多腫瘤患者[2-3]，患者最終會因呼吸衰竭而死亡，因此尋找肺纖維化治療藥物具有重要的意義。本課題組通過動物模型對地龍?zhí)崛∥锟狗卫w維化的有效成分進(jìn)行分析，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及藥物

鹽酸平陽霉素(鹽酸博萊霉素)，8 mg/支，哈爾濱博萊制藥有限公司生產(chǎn)；羥脯氨酸測試盒，哈爾濱佰億成生物科技發(fā)展有限公司;地龍飲片，由本院中藥飲片室提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備

小鼠購回后于室溫20 ℃，自然光照條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。采用博萊霉素氣管內(nèi)注入法復(fù)制大鼠肺纖維化模型。采用暴露式氣管內(nèi)注入法，待麻醉后將大鼠仰臥固定，消毒并切開頸部皮膚，逐層鈍性分離軟組織，暴露氣管,給予鹽酸平陽霉素，給藥量為8.5 mg/kg，正常對照組手術(shù)方法相同，氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。

1.3.2 分組與處理

60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常對照組、模型組和地龍組。地龍組于造模后第2日起給予地龍水提物1.45 g/(kg·d)灌胃；正常對照組、模型組給予等容積生理鹽灌胃。共飼養(yǎng)4周，取材分7 d、28 d兩個時間點(diǎn)進(jìn)行，每次每組10只動物。取右肺下葉組織，用4%的甲醛溶液固定2 d后，做病理檢查。取右肺中葉組織0.02 g，于-20 ℃冰箱保存，備測羥脯氨酸(NYP)含量。

1.3.3 指標(biāo)的測定

肺系數(shù)=肺重/體質(zhì)量；肺組織病理改變；肺組織HYP含量測定(堿水解法)。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組肺系數(shù)變化情況比較

地龍組與模型組比較，肺指數(shù)明顯降低(P<0.05)；7 d時，模型組、地龍組的肺系數(shù)與正常對照組比較，P<0.05，地龍組與模型組比較，P>0.05；28 d時，正常對照組、地龍組與模型組比較，P<0.05。結(jié)果如表1所示。

表1 各組肺系數(shù)變化的比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.2 各組肺病理形態(tài)學(xué)變化

光鏡下，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥；其他3組在7 d時均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，大量炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間隔水腫增厚，各組間鏡下差異不明顯；28 d除正常對照組外，各組均有不同程度的纖維化改變，纖維組織增生間隔增寬，模型對照組尤為嚴(yán)重，地龍組顯示輕度纖維化改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變(HE，×200)

2.3 各組肺組織勻漿羥脯氨酸的測定

7 d時，模型組與對照組相比差異明顯(P<0.05)，28 d時，地龍組和正常對照組比較差異明顯，具有統(tǒng)計意義(P<0.05)，與模型組比較也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如表2所示。

表2 各組肺組織勻漿羥脯氨酸的測定結(jié)果比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病(ILD) 常見的臨床病理改變；以成纖維細(xì)胞的大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集為主要病變特征；呼吸衰竭是肺纖維化患者的最終臨床表現(xiàn)[4]?；颊叩闹形簧鏁r間為2～3年，5年病死率達(dá)到40%，自然緩解率非常低 (<1%)[5-6]。纖維化的致病因素廣泛，空氣污染、各種粉塵、射線損傷、某些藥物和疾病等均可以引起肺纖維化；查不出病因的肺纖維化患者，稱之為特發(fā)性肺纖維化[7]。

肺部間質(zhì)組織發(fā)炎的原因包括空氣污染物、過敏原、細(xì)菌或病毒、吸入有毒氣體、空氣微粒以及香煙等。當(dāng)肺部組織受到刺激，造成免疫反應(yīng)發(fā)生，大量白細(xì)胞自肺部微血管浸潤至肺組織中，分泌許多炎性因子[8]：TNF-α、IL-6、IL-8，白細(xì)胞分泌的炎性因子會吸引更多的白細(xì)胞浸潤，使得發(fā)炎癥反應(yīng)加劇，而白細(xì)胞分泌的蛋白酶會傷害肺部組織。肺纖維化是由于肺臟受到傷害后，在修復(fù)的過程中失調(diào)，肌纖維細(xì)胞及膠原蛋白過度增生，使肺部間質(zhì)形成大量纖維結(jié)締組織。肺部纖維化典型癥狀主要有呼吸困難、逐漸惡化之呼吸急促和干咳。肺部纖維化早期咳嗽無痰，中晚期之后會有少量黏痰，且易出現(xiàn)繼發(fā)感染，痰液會出現(xiàn)膿痰或血痰。肺纖維化可分為繼發(fā)性和特發(fā)性，繼發(fā)性肺纖維化是由于其他疾病導(dǎo)致的二次反應(yīng)，如[9]：自體免疫疾病、肺部感染細(xì)菌或病毒、接受放射線治療等，特發(fā)性肺纖維化是致病原因不明。肺纖維化疾病特征為肺泡組織破壞并伴隨著纖維母細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞異常增生和細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成與堆積。另外近幾年研究證實，氧化壓力是造成肺纖維化的機(jī)制之一，在肺纖維患者的肺纖維細(xì)胞中NADPH oxidase4(NOX4)表現(xiàn)量比正常人多，且NOX4是TGF-1促進(jìn)纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要因子。

最近的藥理學(xué)研究表明，地龍具有退熱作用，可減輕支氣管平滑肌痙攣，抗纖維原性。在許多研究中證實了地龍在不同刺激下的疾病模式中，在不同的器官具有抗發(fā)炎及氧化壓力的效用，即便如此，在肺部發(fā)炎相關(guān)疾病的模式中其保護(hù)效果仍尚未清楚，且作用機(jī)轉(zhuǎn)也須更進(jìn)一步研究。雖然地龍對肺纖維化治療作用已有文獻(xiàn)報道[10]，但是對其藥效研究尤其是在多種肺纖維化模型上的評價并沒有系統(tǒng)研究，此外，其治療肺纖維化的分子機(jī)制也尚未被闡明，這一定程度上限制了該藥物的在肺纖維化治療上的應(yīng)用。本文通過建立博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型，模擬致病因素導(dǎo)致的肺纖維化；利用模型對地龍?zhí)崛∥镞M(jìn)行全面的藥效學(xué)檢測，尋找藥物的敏感模型，本研究表明，地龍組與模型組比較，肺指數(shù)明顯降低(P<0.05)；病理結(jié)果明顯好于模型對照組；HYP含量也明顯降低(P<0.05)。因此，地龍?zhí)崛∥锟刹煌潭雀纳撇┤R霉素所致的小鼠肺纖維，通過研究能夠為臨床上針對不同類型的肺纖維化患者的合理使用提供數(shù)據(jù)支持。