外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化特性及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

周永海，楊麗萍，馬榮雪，董亞萍，張 顯，馬建祥，李 好，魏春華，楊建強(qiáng)，張 勇

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

高溫脅迫影響著農(nóng)作物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，隨著全球氣候變化，氣溫不斷升高，高溫脅迫是限制全球農(nóng)作物生長(zhǎng)的主要因素之一[1-2]。高溫脅迫對(duì)植物的傷害主要包括活性氧引起的氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)變性、酶失活、膜脂過(guò)氧化和核酸(DNA和RNA)損傷。植物已經(jīng)進(jìn)化出了防御系統(tǒng)，這些系統(tǒng)配備了不同的抗氧化成分來(lái)清除過(guò)量產(chǎn)生的活性氧從而保護(hù)植物免受氧化損傷。這些系統(tǒng)的重要的酶是抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)[3-4]。除此之外，植物通過(guò)增加相關(guān)基因的表達(dá)從而保護(hù)植物免受傷害。一般來(lái)說(shuō)，高溫脅迫導(dǎo)致了幾種熱誘導(dǎo)基因的上調(diào)，這些基因通常被稱為“熱休克基因”(HSPS)，編碼熱休克蛋白，這些活性產(chǎn)物對(duì)于植物在致命的高溫下生存是非常必要的[5]。高溫誘導(dǎo)的這些蛋白的表達(dá)大多通過(guò)蛋白折疊保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白不變性，保持其穩(wěn)定性和功能[6]。HSP可分為5個(gè)不同的基因家族，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP20?？傊?，植物通過(guò)提高這些酶的活性和抗逆基因的表達(dá)，維持體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除間的動(dòng)態(tài)平衡，從而使植物免受逆境傷害。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)，是高度保守的并廣泛存在于植物體內(nèi)。1958年，Lerner 等[7]首次從牛的松果體中提取出褪黑素，并證實(shí)它是一種類激素物質(zhì)，參與動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，褪黑素是一種具有較強(qiáng)抗氧化作用的內(nèi)源性自由基清除劑。由于其高親脂性，可輕易通過(guò)生物膜，可作為細(xì)胞內(nèi)自由基清除劑。褪黑激素由于其部分親水性，可以通過(guò)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮抗氧化作用[8]。試驗(yàn)表明，褪黑素可以直接清除·OH、H2O2、ONOO-、NO、LOO·等自由基[9]。

甜瓜是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，近年來(lái)，甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，是效益較好的經(jīng)濟(jì)作物[10]。但夏秋季設(shè)施栽培中高溫往往是制約甜瓜設(shè)施栽培的主要限制因素。因此，本試驗(yàn)通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定適宜的褪黑素處理濃度，研究適宜濃度的外源褪黑素在高溫脅迫下甜瓜生理生化指標(biāo)的變化特性，探討外源褪黑素誘導(dǎo)甜瓜幼苗耐熱性的可能機(jī)理，為夏秋季甜瓜設(shè)施栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年3月至7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行，供試品種為‘農(nóng)大甜5號(hào)’，種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜課題組提供。選取飽滿、大小一致的甜瓜種子，置于 28 ℃人工氣候箱內(nèi)恒溫催芽12～24 h，種子露白后，播種于50孔穴盤育苗。置于RXZ智能型人工氣候箱(寧波江南儀器廠制造)，培養(yǎng)條件為；晝14 h(32 ℃)/夜10 h(20 ℃)光照度為8 000 lx，相對(duì)濕度為80%，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)將幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽(10 cm×10 cm)中，每隔2 d澆1次1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每缽用量為20 mL。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)挑選生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行處理，常溫下噴施蒸餾水作對(duì)照(CK)、高溫下噴施蒸餾水(HT)和高溫下噴施150 μmol/L的褪黑素(MTHT)。每個(gè)處理15株共重復(fù)3次，連續(xù)噴施3 d(以葉面欲滴又不滴水為宜)，然后在人工氣候箱內(nèi)(光周期36 h，光照度8 000 lx)進(jìn)行 43±1 ℃高溫處理，同時(shí)設(shè)置32 ℃的常溫對(duì)照(對(duì)照除與高溫處理溫度不同外，其余條件均一致)。處理36 h后統(tǒng)計(jì)熱害指數(shù)，并采集幼苗功能葉片和根(儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱中)進(jìn)行各種生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 熱害指數(shù)的統(tǒng)計(jì) 熱害指數(shù)分級(jí)參照鄧嬌燕等[11]的方法，受害級(jí)別：0 級(jí)，生長(zhǎng)正常，未受傷害；1 級(jí)，僅少數(shù)葉片邊緣有輕度的褶皺萎縮；2級(jí)，半數(shù)以下的葉片萎蔫死亡；3 級(jí)，半數(shù)以上的葉片萎蔫死亡；4 級(jí)，植株全部死亡。

熱害指數(shù)=∑[各株級(jí)數(shù)/(最高級(jí)數(shù)×總株數(shù))]×100%

1.2.2 鮮質(zhì)量含水量和根系活力的測(cè)定 每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗，用去離子水沖洗干凈，稱其鮮質(zhì)量，然后將幼苗烘干至恒量，稱其干質(zhì)量，鮮質(zhì)量含水量=100×(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量×100%。根系活力采用TTC法測(cè)定[12]。

1.2.4 活性氧和抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測(cè)定[15]，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)Wang等[16]方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR) 活性。

1.2.5 RNA提取及熒光定量PCR分析 葉片總RNA用試劑盒(RNAsimple Total RNA ，Tiangen， Beijing)提取，總RNA反轉(zhuǎn)錄用(FastKing cDNA First Chain Synthesis Kit)試劑盒進(jìn)行，得到cDNA模板。用Primer 6設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物，以甜瓜actin作為內(nèi)參基因。特異性引物序列如表1所示。使用IQ5實(shí)時(shí)定量?jī)x(Bio-rad, 美國(guó))進(jìn)行熒光定量分析，定量試劑盒選用SYBR○RPremix ExTap TMⅡ (2×)試劑盒(Takara, Tokyo, Japan)擴(kuò)增PCR。反應(yīng)體系中包含SYBR熒光染料10 μL， cDNA 模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX 0.2 μL最后用ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s、58 ℃退火 20 s、72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism軟件作圖，采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，多重比較采用Duncan’s檢驗(yàn)(P<0.05顯著水平)。圖表數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗含水量和熱害指數(shù)的影響

在高溫處理前3種處理的甜瓜幼苗形態(tài)一樣，高溫處理36 h后，與CK相比HT和MTHT鮮質(zhì)量含水量均下降，分別下降5.09%和 2.21%，各處理之間差異顯著。高溫脅迫后，與CK相比HT和MTHT熱害指數(shù)均升高，但MTHT較HT熱害指數(shù)降低44.14%，MTHT明顯地緩解了高溫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用 (表2)。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR amplification

表2 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗含水量和熱害指數(shù)Table 2 Relative water content and heat damage index of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

注：數(shù)值代表“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。同列不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Each value represents the “mean±standard deviation”.The different lowercase letters in same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗根系活力的影響

由圖1可以看出，高溫脅迫36 h后，與CK相比，MTHT甜瓜幼苗的根系活力升高，但差異不顯著，HT根系活力下降，HT與MTHT差異顯著。

2.3 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度和產(chǎn)生速率的影響

2.4 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

由圖3可以看出，甜瓜葉片SOD與CAT變化趨勢(shì)一致，與CK相比，HT的SOD和CAT活性分別下降11.28%和45.79%，MTHT提高SOD和CAT活性,分別比CK提高24.51%和25.71%，HT和MTHT差異顯著，CK與MTHT處理差異不顯著。高溫脅迫36 h后處理HT和MTHT均提高了POD活性，但CK與MTHT和HT差異顯著。

2.5 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗抗壞血酸相關(guān)酶活性的影響

由圖4可以看出，甜瓜葉片DHAR和MDHAR變化規(guī)律一致，高溫脅迫顯著地降低了這2個(gè)酶的活性，高溫脅迫后，HT分別比CK降低20.27%和47.51%，褪黑素處理后幼苗在高溫脅迫下仍維持較高的抗壞血酸循環(huán)相關(guān)酶活性，DHAR活性較CK沒(méi)有顯著性差異，MDHAR活性較CK提高46.23%，高溫脅迫后HT和MTHT的APX活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且各處理之間差異顯著。

圖中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

The different lowercase letters in the same figure indicate significant difference(P<0.05)，the same below

圖1 外源褪黑素處理及高溫
脅迫下甜瓜幼苗根系活力
Fig.1 Root activity of melon seedlings under exogenous
melatonin and high temperature stress

2.6 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下甜瓜幼苗抗逆基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步地了解褪黑素響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制，對(duì)3個(gè)蛋白保護(hù)(HSP70、HSP90和HSP101)基因和抗氧化酶(SOD和APX)基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果如圖5所示：HSP70、HSP90、HSP101、SOD、APX基因表達(dá)量在高溫脅迫后均有不同程度的上調(diào)，HSP70、HSP90和HSP101與CK相比分別上調(diào)了12.69倍、44.42倍和287.20倍，HT處理后這3個(gè)基因分別上調(diào)了 2.72倍、14.03倍和63.97倍，HSP70與CK差異不顯著。SOD和APX表達(dá)分析結(jié)果顯示，與CK相比HTMT均顯著上調(diào)表達(dá)，HT與CK相比，有輕微的誘導(dǎo)，但與CK差異不顯著。

圖2 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度和產(chǎn)生速率Fig.2 MDA molality and production rate in leaves of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

圖3 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzymes activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫是最具有破壞性的環(huán)境脅迫之一。高溫脅迫后，植物生長(zhǎng)受到不同程度的影響，表觀體現(xiàn)于形態(tài)結(jié)構(gòu)變化上[10]。本試驗(yàn)表明，高溫脅迫顯著的降低了甜瓜幼苗的相對(duì)含水量、熱害指數(shù)和根系活力，而外施褪黑素緩解了高溫對(duì)甜瓜幼苗造成的傷害。

圖4 外源褪黑素處理及高溫脅迫下甜瓜幼苗抗壞血酸相關(guān)酶活性Fig.4 Ascorba-related enzyme activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

圖5 外源褪黑素處理及高溫脅迫下抗逆基因表達(dá)Fig.5 Expression of anti-stress genes under exogenous melatonin and high temperature stress

熱休克蛋白作為伴侶分子，是由熱脅迫誘導(dǎo)的，以保護(hù)細(xì)胞蛋白免受不可逆的熱誘導(dǎo)損傷[22]。 HSP70和HSP60蛋白是其中最保守的蛋白之一，在熱應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用[23]。在玉米中，ABA和HSP70的交互作用抵消了熱脅迫對(duì)蛋白質(zhì)和酶的影響，保護(hù)它們不發(fā)生錯(cuò)誤折疊和蛋白水解[24]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)外源褪黑素處理后強(qiáng)烈地誘導(dǎo)HSP70、HSP90和HSP101的表達(dá)，從而增加HSPs的產(chǎn)生，保護(hù)宿主細(xì)胞免受熱休克引起的損傷。

綜上表明，外源褪黑素可以提高甜瓜的耐熱性并為甜瓜幼苗在熱脅迫下更好地生長(zhǎng)提供了一種途徑。但要闡明褪黑素與HSP表達(dá)之間的關(guān)系及其增強(qiáng)翻譯還需要進(jìn)一步研究。