陜西不同地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的分離鑒定及同源性分析

劉 晨，楊藝煒，王家哲，常 青，洪 波，張 鋒

(陜西省生物農業研究所，西安 710043)

馬鈴薯俗稱土豆，作為全球第四大糧食作物在農業生產中具有舉足輕重的地位[1]。但中國馬鈴薯產業一直飽受病害困擾，馬鈴薯病害嚴重制約國內馬鈴薯單位面積產量的提升以及馬鈴薯產業的進一步發展，目前陜西省馬鈴薯產業面臨著同樣問題。甘薯已經成為中國許多省(區)調整農業產業結構，促進農村產業發展的重要作物，甘薯在陜西省也逐步成為重要經濟作物，對于帶動區域農業經濟發展具有重要意義。馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)也被稱為Potato nematode，最初發現于馬鈴薯上，是其貯藏期一種重要病害[2]，也是嚴重為害馬鈴薯的重要病原之一[3]。在中國，馬鈴薯腐爛莖線蟲首次在甘薯上被分離出來，發生嚴重時可造成80%以上的減產，甚至絕收[4-5]。此外，腐爛莖線蟲還可為害蠶豆、小麥、當歸、三七等幾十種農作物及中藥材[6]。

馬鈴薯腐爛莖線蟲目前主要分為2類基因型，有文獻[7]報道這2個基因型在尾長、C值、V值等形態特征值上存在顯著差異。2007年，有學者[8]對多個馬鈴薯腐爛莖線蟲種群的核糖體ITS區序列進行比對，發現在中國不同地理種群明顯分為2個生物型，即A型和B型這兩種。此外，還有多篇文獻也證實馬鈴薯腐爛莖線蟲種群中存在2類基因型這一結論[9-11]。有國外學者將不同寄主作物上的馬鈴薯腐爛莖線蟲群體分為A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型這7個不同生物型[12-13]。A型僅在中國發現，且只為害甘薯，B型和E型主要為害甘薯和馬鈴薯，C型寄主為馬鈴薯、甘薯及大蒜，D型可侵染大蒜，F型在甘薯和黃芪上有分離出來，G型為害馬鈴薯。

1925年，馬鈴薯腐爛莖線蟲首次在美國甘薯上被發現[14]，傳入中國后，在北京、山東、河北等甘薯生產區均造成嚴重為害[15]。馬鈴薯腐爛莖線蟲在國外主要為害馬鈴薯，在國內主要為害甘薯，但近幾年，在甘肅等地也發現此線蟲為害馬鈴薯[16-18]。因此，明確該病原線蟲的生物型及系統發育地位，可為其致病性研究奠定基礎，同時為馬鈴薯及甘薯生產區腐爛莖線蟲的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年3月至12月期間，馬鈴薯腐爛莖線蟲采自陜西省榆林市定邊縣、靖邊縣、神木縣及榆陽區的馬鈴薯發病田，及陜西省渭南市合陽縣及興平市的甘薯發病田。

1.2 試驗方法

1.2.1 線蟲的分離 將不同地區采集病薯的典型病塊區切下，切成1 cm×1 cm小塊，清水沖洗干凈，取雙層面巾紙將其包住，采用漏斗分離線蟲。收集到的線蟲用0.5%次氯酸鈉浸泡、消毒5 min，無菌水沖洗3遍，保存，備用。

1.2.2 形態學鑒定、線蟲標本制作及特征值測量 將分離得到的腐爛莖線蟲懸浮液，置于65 ℃水浴處理0.5 min熱力殺死[19-21]，并制成玻片以供觀察。應用EZcam軟件，在顯微鏡下對腐爛莖線蟲的主要形態特征進行觀察、測量及拍照。主要測量數據包括線蟲的體長(L)、體寬(W)、口針長度(S)、頭長(H)、尾長(T)等[22]，對比不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲在形態上的差異。每組測量20條線蟲，計算平均值。

掃描電鏡觀察：將線蟲置于裝有5%戊二醛的離心管中于4 ℃下固定3 h，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液進行沖洗之后，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲，用超聲波清洗儀將線蟲于30 ℃條件下清洗30 min，經體積分數依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級脫 8 min，離心2 min。再依次用乙酸異戊酯與無水乙醇體積比分別為1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的乙酸異戊酯與無水乙醇混合液置換，每步置換6 min，離心2 min，EMITECH-K850型臨界點干燥儀干燥，MSP-1S型離子濺射儀噴金鍍膜，在HITACHI-3400N型掃描電子顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 分子生物學鑒定提取線蟲DNA 向1.5 mL離心管內加入16 μL×PCR Buffer(去Mg2+)、4 μL蛋白酶K、40 μL ddH2O，再將線蟲放入混合液中；將離心管置于液氮中研磨，反復研磨3次；離心管水浴65 ℃保溫90 min；再放置 85 ℃金屬浴10 min，取出放至室溫即可用于PCR擴增。

PCR擴增條件：反應選取腐爛莖線蟲線粒體COI通用引物、核糖體ITS通用引物及A型生物型及B型生物型的特異性引物(表1)。

表1 用于鑒定馬鈴薯腐爛莖線蟲的引物Table 1 Primers of Ditylenchus destructor

PCR反應體系為2×TaqMix 25 μL(上海生工)，20 μmol/L上游引物2 μL，20 μmol/L下游引物2 μL，DNA模板2 μL，H2O補充總體積至50 μL。PCR 擴增反應為95 ℃預變性4 min， 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35個循環；72 ℃最后延伸7 min，PCR產物4 ℃保存。PCR反應結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 系統發育樹構建 將PCR產物送至上海生工生物工程有限公司，進行測序(Sanger 測序)。利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)分別對線粒體COⅠ及核糖體ITS序列進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 腐爛莖線蟲形態學鑒定

在40倍顯微鏡下觀察可見，雌性腐爛莖線蟲溫熱死亡后蟲體略向腹部彎曲，蟲體表角質膜上有細環紋，環距1 μm ，唇區低且平滑，稍突出于體外，頭區與體軀之間有一輕微的溢縮。蟲體側寬約占整體寬的1/5 ，側線6 條(圖1)。食道屬墊刃型，口針細小，長10～13 μm ，口針基球小而明顯，呈圓形(圖2)。中食道球卵圓形，肌肉質，具瓣門。狹部窄，其上環繞神經環。后食道腺體從背面或側面交蓋腸的前端，約交蓋半個體寬至1 個體寬。后陰子宮囊明顯，其長度一般為陰門到肛門距離的2/3。卵母細胞在近子宮處單行排列。后陰子宮囊長約達陰門至肛門距離的3/4 位置處。尾圓錐形，略向腹部彎，尾端細圓(圖2)。

雄蟲蟲體前端形態與雌性蟲形態相似，尾略窄，尾端細圓；交合刺略向腹部彎曲。交合傘始于交合刺前端相對應的位置，向后伸約尾長的75%，基部膨大, 其寬處有2個指狀突起；引帶簡單且短(圖2)。

2.2 不同生物型腐爛莖線蟲特征值測量

對不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲雌、雄成蟲各測量20頭，測量結果見表2。

A.6面輻射狀唇片；B.交合傘始于交合刺前端；C.體中側區6條側線

A.Six radial labrum; B.Copulatory bursa begins at the front of speculum; C.Six lateral lines of middle body side

圖1 馬鈴薯莖線蟲掃描電鏡照片
Fig.1 Stereoscan photograph ofDitylenchusdestructor

A.雄蟲交合刺側面及交合傘；B.交合刺腹面及指狀；C.雌蟲陰門及尾部；D.頭部溢縮及口針；標尺：A/B/C=25 μm，D=10 μm

A.Spiculum lateral surface and copulatory bursa of male; B.Segmental venter and finger of speculum; C.Cunnus and tail of female; D.Excessive shrinkage and lancet of head; scaleplate:A/B/C=25μm，D=10μm

圖2 馬鈴薯腐爛莖線蟲顯微鏡下特征形態Fig.2 Characteristic morphology under microscope of Ditylenchus destructor

注：a=體長/體寬；b=體長/體前部至腸前端距離；c=體長/尾長；V=體前端至陰門距離×100/體長。

Note:a=Length/width;b=Length/distance from anterior body to anterior intestine;c=Length/Tail;V=Distance from anterior end of body to vulva×100/length.

從表2可以看出，無論B型還是A型腐爛莖線蟲的雌成蟲均比雄成蟲體長長，體寬也略寬，合陽與興平的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲雌成蟲與雄成蟲在體長、a值、b值、c值及V值之間差異不顯著，B型腐爛莖線蟲雌成蟲與雄成蟲的體長均比A型的顯著減小，雌成蟲的V值B型比A型小，但a值B型高于A型，b值、c值差異不顯著。測量結果與郭全新等[19]、劉維志等[20]的測量結果基本一致。

2.3 腐爛莖線蟲分子鑒定

2.3.1 不同地區莖線蟲線粒體COI及核糖體ITS通用引物檢測結果 通過馬鈴薯腐爛莖線蟲的線粒體通用引物擴增陜北及關中合陽、興平的線蟲群體，從凝膠成像結果來看，所有樣品都擴增出480 bp條帶(圖3)。用馬鈴薯腐爛莖線蟲ITS通用引物進行PCR擴增，結果顯示，為害陜北馬鈴薯的莖線蟲均有約950 bp的條帶，關中合陽、興平甘薯上莖線蟲均擴增出約760 bp的條帶(圖4)。因此可以確定所有這些線蟲樣品均為馬鈴薯腐爛莖線蟲。

2.3.2 不同地區腐爛莖線蟲生物型鑒定結果 為確定不同地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型是否相同，選取A型與B型的特異性引物擴增陜北、合陽及興平的馬鈴薯種群。從圖5可以看出，榆林地區靖邊縣、定邊縣、神木縣及榆陽區為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲，合陽縣及興平市采集的為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲。

圖3 ITS區通用引物擴增結果Fig.3 Universal primer amplification of rDNA-ITS

2.4 rDNA-ITS序列分析及系統發育樹構建

對馬鈴薯腐爛莖線蟲核糖體ITS通用引物擴增產物測序結果在NCBI上BLAST比對后發現，陜北B型種群與登錄號為JZ133363、JZ133338的B型馬鈴薯腐爛莖線蟲群體同源性高達99.5%，關中A型種群與A型的MH992393的同源性高達99.1%。

使用腐爛莖線蟲核糖體ITS通用引物對陜北不同地區、合陽及興平的種群進行擴增及測序，利用MEGA6.0軟件，將這7個序列及NCBI上已知的5個序列號為JZ133363、JZ133338的B型及MH992393的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲種群分別構建系統發育樹(圖6)。從結果來看，種群DingB、JingB、ShenM及YuY的rDNA-ITS序列與已知序列MK979365、JZ133411聚為一支。XingP、HeY和 HeY2聚在一支。合陽的兩個不同樣品遺傳距離最近，與興平種群親緣性高，這3個種群均為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲，陜北的定邊縣及靖邊縣的種群遺傳距離最近，與神木縣及榆陽區的莖線蟲種群親緣性較高，這4個種群均為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲。同時，此系統發育樹成功將A型、B型兩個種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲成功區分開。此結果與分子鑒定結果較為一致。

圖4 線粒體通用引物擴增結果Fig.4 Universal primer amplification of mtDNA

圖5 A型、B型特異性引物擴增結果Fig.5 Specific primer amplification of type A and B

圖6 馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Ditylenchus destructorrDNA-ITS

3 結論與討論

通過對中國馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS序列對比可以看出，其種群主要分為A型和B型2個基因生物型[8,23]，但關于這2個生物型群體在形態特征、寄主范圍、病理學上等方面差異的研究較少[18]。本研究首次在陜西省發現該線蟲為害馬鈴薯及甘薯，并首次對陜西不同地區、不同寄主上該線蟲的生物型進行了形態學與分子生物學鑒定。結果顯示，侵染陜西省榆林馬鈴薯的為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲，侵染陜西省合陽及興平甘薯的為A型。形態特征值的測量結果顯示，A型馬鈴薯腐爛莖線蟲比B型的體長長，體寬略寬，雌成蟲的V值較大，但a值B型馬鈴薯腐爛莖線蟲高于A型，b值、c值差異不顯著。不同地區相同生物型的莖線蟲，在形態特征值上差異并不顯著。構建系統發育樹，成功將A型、B型2個種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲區分開。

有研究[18,23-24]表明：中國山東、河北及江蘇等地甘薯上馬鈴薯腐爛莖線蟲可分為A型、B型2個生物型；有學者[12]在此基礎上將馬鈴薯腐爛莖線蟲種群分為A-G型7個單元型，A-F單元型均在中國有發生，而G型并未發現。關于陜西省是否還存在馬鈴薯腐爛莖線蟲的其他生物型，及不同生物型發生區域、侵染作物種類、生物特性及其他分子生物學方面是否存在差異，還需進一步調查研究，這將對有效預防及控制馬鈴薯腐爛莖線蟲的擴散提供理論依據。