龜甲膠原蛋白的提取工藝研究

張百剛，梁海榮，馮再平，鹿琪坤，李金亮

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050)

烏龜(Chinemysreevesii)是我國的傳統物種，故國外有關研究很少，楊文鴿等[1]研究表明，烏龜的水分、總糖、總灰分、蛋白質、氨基酸以及脂肪酸等營養成分含量極高。龜甲(Carapax et Plustrum Testudinis)為龜科動物烏龜的背甲及腹甲[2]。龜甲具有豐富的活性物質，如多酚類物質、礦物質元素、甾體類、羥脯氨酸、脂肪酸等[3]。龜甲有滋陰潛陽、益腎強骨、養血補心的藥理功效，用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈目眩、虛風內動、筋骨痿軟和心虛健忘等癥狀[2]。我國食用烏龜者大多棄甲而食，造成了極大的浪費且污染環境。因此，本研究以廢棄龜甲為原料，提取其膠原蛋白，為龜甲的綜合利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龜甲收集于農貿市場。試劑：胃蛋白酶、乙酸乙酯、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、85%磷酸、均為分析純。

FA2104型電子分析天平，美國UniVersal低溫高速離心機，HH-S數顯恒溫水浴鍋，UV-9200型紫外可見光分光光度計，日本島津真空冷凍干燥機，真空干燥箱，凱氏定氮儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 工藝流程：龜甲→洗凈→烘干→粉碎→烘干→脫脂→酶解→離心→冷凍干燥→稱重→測蛋白含量[4]。

操作要點：使用乙酸乙酯脫脂，胃蛋白酶酶解，離心條件為8000 r/min下離心15 min、棄沉淀，冷凍干燥48 h,并測定蛋白質含量，按照公式計算蛋白質的提取率。

蛋白提取率/%=[凍干膠原蛋白總含量(g/g)×凍干粗品質量(g)×100%]/初始龜甲粉質量(g)

1.2.2 試驗內容

1.2.2.1 脂肪含量的測定 索氏抽提法脫脂：參考國家標準GB 5009.6─2016。

1.2.2.2 蛋白質含量的測定 (1)凱氏定氮法：參考國家標準GB 5009.5─2016；(2)考馬斯亮藍法：具體步驟參考文獻[5],繪制標準曲線參照文獻[6],代入下面公式得到樣品蛋白質含量。

樣品蛋白質含量/(g/g)=樣品蛋白質濃度(mg/mL)×提取液的總體積(mL)/樣品干重(mg)

1.2.2.3 脫脂時間確定 準確稱取10 g龜甲粉加入100 mL的錐形瓶中，再加入50 mL的乙酸乙酯，搖勻，在通風處進行，分別放置3、4、5、6、7、8 h，測定龜甲粉中的脂肪含量，并記錄數據。

1.2.2.4 單因素試驗 (1)pH值對膠原蛋白初步提取的影響：準確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，在酶用量4%、底物濃度6%、酶解溫度37 ℃、酶解時間4 h的條件下，pH值分別為1.0、1.5、2.0、2.5的條件下處理龜甲，在8000 r/min下離心15 min，棄沉淀，用凱氏定氮法測定總氮含量，乘以蛋白系數計算膠原蛋白的含量，探討了不同pH值對膠原蛋白初步提取的影響。

(2)酶用量對膠原蛋白初步提取的影響：準確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶用量為3%、4%、5%、6%的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶用量對膠原蛋白提取率的影響。

(3)溫度對膠原蛋白初步提取的影響：準確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶解溫度為32、37、42、47 ℃的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響。

(4)時間對膠原蛋白初步提取的影響：準確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶解時間為3、4、5、6 h的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶解時間對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.5 響應面試驗設計 運用Box-Behnken Design設計原理，在單因素試驗的基礎上，取酶用量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)等3個因素，以膠原蛋白的含量為響應值，設計3因素3水平的中心組合試驗，試驗因素與水平設計見表2。

1.2.2.6 數據分析 每個樣品做3個平行，用Excel 2007軟件將數據處理并求出平均值和標準誤差。用Design expert 10軟件進行響應面的數據分析。

2 結果與分析

2.1 脫脂時間的確定

未脫脂之前，測得龜甲粉中的可溶性物質含量大約為45.63%。由圖1可知，隨著脫脂時間的變長，龜甲中的脂肪含量越來越少，脫脂時間達到6 h，龜甲中的脂肪含量最低，再增加脫脂時間，則龜甲中的脂肪含量幾乎不變，且穩定在1.40%左右。根據資料顯示，脂肪的存在，會干擾膠原蛋白的提取，為了有效地進行試驗，最佳脫脂時間確定為6 h。

圖1 龜甲中脂肪含量的變化

圖2 酶解pH值對膠原蛋白含量的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶解pH值對膠原蛋白提取量的影響 由圖2可知，隨著酶解pH值增大，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當酶解pH值增大到1.5時，此時的膠原蛋白含量出現最高值，當再增大其酶解pH值時，膠原蛋白含量出現下降的趨勢。pH值過高過低都會影響酶活性，故將pH值1.5確定為胃蛋白酶的最佳酶解時間。

2.2.2 酶用量對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖3可知，隨著酶用量的升高，膠原蛋白的含量也在慢慢增大，當酶用量增大到4%時，此時的膠原蛋白含量出現最高值，當再增大其酶用量值時，其膠原蛋白含量呈現先不變再快速下降的趨勢，故將酶用量4%確定為胃蛋白酶的最佳酶用量。

其原因是酶作為一種生物催化劑，對底物的催化能力存在一定的飽和度，剛開始是隨著酶與底物的結合是趨于飽和的，因此膠原蛋白的含量會增加，當酶用量達到一定飽和值時，這時過多的酶會將龜甲中的膠原蛋白溶解，反而使膠原蛋白含量下降[7]。

圖3 酶用量對膠原蛋白含量的影響

圖4 酶解溫度對膠原蛋白含量的影響

2.2.3 酶解溫度對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當酶解溫度升高到37 ℃時，此時的膠原蛋白含量出現最高值，當再升高酶解溫度時，其膠原蛋白含量呈現出緩慢下降的趨勢，故最佳酶解溫度為37 ℃。可能因為酶是由活細胞產生的一種特殊蛋白質，具有高效的催化作用，對底物的高效催化能力需要在一定的條件下，如最適溫度、最適pH值等。

2.2.4 酶解時間對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖5可知，隨著酶解時間的延長，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當酶解時間接近5 h時，膠原蛋白含量出現最佳值，當酶解時間再增大時，其膠原蛋白含量出現急速下降的趨勢，故最佳酶解時間為5 h。酶解時間過短，則底物與酶的接觸時間不夠，使得酶解不充分；酶解時間過長，則酶有可能將龜甲中的膠原蛋白溶解。

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面試驗結果 試驗中心組和設計水平如表1所示，試驗結果與方案見表2，利用Design expert 10軟件對試驗數據進行分析，得到回歸方程[8-9]：

CC(g/g)=0.12-0.010375A-0.013375B+0.003C-0.01225AB-0.0205AC-1.23759×10-19BC-0.013375A2-0.004875B2-0.012625C2

圖5 酶解時間對膠原蛋白初步提取的影響

表1 Box-Behnken中心組合設計水平

表2 試驗方案與結果

2.3.2 方差分析 整理數據得該擬合的二次回歸模型及各項方差分析結果如表3所示，一次項中A的回歸系數顯著，說明酶用量對提取膠原蛋白含量的影響顯著，一次項中B的回歸系數極顯著，說明酶解溫度對提取蛋白含量的影響是極顯著；交互項AB的偏回歸系數顯著，說明酶用量和酶解溫度對提取蛋白含量有顯著的影響，交互項AC的偏回歸系數極顯著，說明酶用量和酶解時間對提取蛋白含量有極顯著的影響；2個二次項A2、C2的偏回歸系數均達到顯著水平[9]。回歸模型是極顯著的(P=0.0091<0.05),模型R2=0.5050，說明模型擬合程度一般，能夠反映數據50.50%的有效性，失擬項F值為0.40(P=0.7596>0.05)，表明失擬項不顯著，試驗誤差較小，用此模型對胃蛋白酶酶解提取龜甲膠原蛋白工藝優化的預測是可行的。遺憾的是，此模型的決定系數R2為0.5050，模型的調整確定系數R2為0.7656，它們之間相差0.2606，超過0.2。這表明此模型或數據可能有一個大的塊效應問題。需要考慮的是模型還原、響應變換、異常值等，因此在以后的試驗中需要有所改進。

表3 回歸方程方差分析

注：*、**分別表示在0.05、0.01水平上的差異顯著性。下同。

2.3.3 回歸模型的優化 由于交互項中BC、二次項B2對提取蛋白含量沒有顯著的影響，因此采用手動優化法對回歸模型再一次進行優化，優化結果為FC(15.93)>FB(14.14)>FA(9.59)，因此各因素對于龜甲中提取蛋白的影響大小順序依次是：酶解時間(C)>酶解時間(B)>酶用量(A)。

2.3.4 響應面曲面分析 根據回歸方程做出響應面考察擬合響應曲面的形狀，可直觀地描述各個因素之間的交互項的相互影響。等高線形狀反映各個交互項之間作用的強弱，若為圓形則表示各因素的交互作用效果不顯著，若為橢圓形則表示顯著。如圖6、圖7所示的響應面和等高線可以看出各因素之間的交互作用，酶用量和酶解溫度的交互作用、酶用量和酶解時間的交互作用的等高線形狀均為橢圓形，因此酶用量和酶解溫度的交互作用、酶用量和酶解時間的交互作用均顯著。

如圖6所示，隨著酶用量A和酶解溫度B的增大，蛋白含量先上升，達到最高點后，又逐漸下降，說明酶用量A和酶解溫度B只有趨于某一中間值時，能使提取的蛋白含量達到最大值。

如圖7所示，隨著酶用量A和酶解時間B的增加，蛋白含量先快速上升，達到最高點后，一邊明顯下降，一邊有上升的趨勢，可能是試驗操作的誤差帶來的結果或者最佳范圍未在該區域。

圖6 Y=(A.B)的等高圖和響應面圖

2.3.5 試驗驗證 對試驗模型進行分析可得胃蛋白酶解龜甲提取蛋白的最佳理論工藝條件為：酶用量3.945%、酶解溫度38.070 ℃、酶解時間4.754 h，此條件下的蛋白含量為0.114 g/g；考慮到實際操作的可行性，對所得工藝修正為酶用量4%，酶解溫度40 ℃，酶解時間5 h，采用此工藝實際測得蛋白含量為0.111 g/g，提取率為11.08%，與理論值相對標準偏差(RSD)為0.26%，說明采用響應面法得到的工藝參數可靠，具有一定的應用價值。

圖7 Y=(A.C)的等高圖和響應面圖

2.3.6 考馬斯亮藍法測定膠原蛋白含量

2.3.6.1 標準曲線的試驗 標準曲線的試驗方案與結果見圖8。

圖8 牛血清蛋白標準曲線

2.3.6.2 龜甲膠原蛋白含量測定結果 如表2所示，考馬斯亮藍法測定的膠原蛋白含量總體略低于凱氏定氮法測定的蛋白含量，可能因為考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合反應十分迅速，2 min左右即達到平衡，其結合物室溫下1 h內基本保持穩定，但在20 min之后線性略有降低，對試驗結果有一定的誤差[10]；考馬斯亮藍法和凱氏定氮法測定出的蛋白含量總體呈現出一致性，表示考馬斯也可用來測定此膠原蛋白的含量，而且考馬斯測定蛋白質相比凱氏定氮法更加節省時間和試劑，不足之處是考馬斯亮藍法沒有凱氏定氮法測定蛋白靈敏、準確；總的來說，考馬斯亮藍法和凱氏定氮法都可以用來測定該蛋白的含量。

3 結論

本試驗在脫脂、單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化龜甲提取膠原蛋白的工藝參數，并進行驗證試驗，最終確定龜甲膠原蛋白最佳提取工藝為酶用量4%，酶解溫度40 ℃，酶解時間5 h，pH值1.5，提取的膠原蛋白含量為0.111 g/g。