干熱河谷特色植物余甘子中沒食子酸含量的測定

楊曉瓊，孔維喜，袁建民，許智萍，雷 虓，何 璐*

(1.云南省農業科學院 熱區生態農業研究所，云南 元謀 651300；2.元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)為大戟科葉下珠屬落葉小喬木，又名橄欖子、牛甘果、庵摩落迦果、土橄欖，原產于印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、馬來西亞、菲律賓、泰國等地，我國主要分布于廣東、福建、廣西、海南、云南、四川、貴州等省份，盛產于云南、福建[1]。余甘子具有健胃、清熱、消食、降火、解毒等功效[2]，富含黃酮、酚類、蛋白質、氨基酸、生物堿等物質[1]，具有抗氧化[3]、抗菌[4]、抗腫瘤、調節免疫力[5]等作用，因此被中華人民共和國國家衛生健康委員會列入“藥食同源”的名單[6]，余甘子的藥用活性成分中以沒食子酸為主，據現代藥理研究表明沒食子酸具有抗氧化、清除自由基、保肝、降血脂、抗腫瘤、抗菌消炎等作用[7]。云南地區除迪慶州以外，各地均有分布，以干熱河谷地區分布較多。目前，利用高效液相色譜法測定余甘子中沒食子酸含量的報道較多，但以干熱河谷地區為主測定余甘子中沒食子酸含量的研究未見詳細報道。

現有研究中利用高效液相色譜法測定余甘子中沒食子酸含量多采用等度洗脫的方式來測定[8-10]，但余甘子因受生態因子(溫度、海拔、光照、濕度)、品種、產地、栽培方式等的影響，相同時間采摘的余甘子樣品的成熟度不一致，導致所含的化學成分含量有差異[11]。余甘子未完全成熟前，含有大量的粘酸，粘酸易吸附色譜柱，隨著成熟度的增加，粘酸逐漸降解，沒食子酸的含量相對增加[11-13]。余甘子果肉中富含鞣質，含量高達11.4%[14]，與粘酸一樣，鞣質易吸附在色譜柱上，出峰時間受到影響，保留時間提前，尤其是利用高效液相色譜法大批量測定余甘子樣品時此種現象最為嚴重。目前文獻中還沒有這方面的相關研究。為排除粘酸及鞣質的影響，保證實驗的準確性以及余甘子樣品的大批量測試，本實驗采用梯度洗脫的方式來測定余甘子樣品中沒食子酸的含量。

本研究利用高效液相色譜法測定余甘子中沒食子酸含量可為其藥用價值提供一定的理論依據，同時優化提取方法和色譜條件，為干熱河谷地區特色植物余甘子藥材全面質量控制提供科學理論依據[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 實驗用的5批余甘子樣品：賓川盈玉(BCYY)、賓川卷葉(BCJY)、賓川野生(BCYS)、元謀野生(YMYS)、元江野生(YJYS)，相同時間采集后于60 ℃條件下烘干，粉碎后過40目篩，備用。

丙酮、磷酸均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純；沒食子酸對照品(批號：110831-201204，純度：90.8%)；高純水。

1.1.2 儀器與設備 Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX Eclipse XRD-C18色譜(4.6 mm×250 mm,5 μm)；鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；粉碎機(永康市速峰工貿有限公司)；電子分析天平(美國HZK-FA210公司)；超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；0.45 μm微孔濾膜。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XRD-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(表1)；進樣量5 μL，檢測波長273 nm，柱溫30 ℃。

表1 流動相乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)的梯度洗脫過程

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取35 mg沒食子酸對照品，置于10 mL容量瓶中，加入50%的甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為3.5 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 余甘子烘干、粉碎后過40目篩，準確稱取1.0 g余甘子粉末，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL 50%的丙酮溶液，浸漬12 h，超聲提取90 min，放冷，利用旋轉蒸發儀濃縮至浸膏，加入甲醇溶液定容至10 mL容量瓶，搖勻，用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，取濾液，待用。

1.2.4 線性關系的考察 精密吸取沒食子酸對照品溶液適量，用50%的甲醇分別配制成含沒食子酸0.015、0.0625、0.25、1.00、2.00、3.00、3.50 mg/mL的對照品溶液，按1.2.1的色譜條件進行測定。

1.2.5 檢出限實驗 取1.2.2條件下濃度為3.50 mg/mL的沒食子酸對照品溶液適量，倍比稀釋，按1.2.1色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。當信噪比為3∶1時，得檢出限。

1.2.6 精密度實驗 取配制好濃度為3.50 mg/mL的沒食子酸對照品溶液適量，按1.2.1色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。

1.2.7 穩定性實驗 在室溫下考察余甘子中提取的沒食子酸成分的穩定性，取供試品賓川盈玉(BCYY)溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h按1.2.1色譜條件進行測定，記錄峰面積。

1.2.8 重復性實驗 分別精密稱取同一批賓川盈玉(BCYY)樣品6份，按1.2.3條件制備供試樣品，再按1.2.1色譜條件進行測定，記錄峰面積。

1.2.9 加標回收率實驗 稱取6份已知含量的賓川盈玉(BCYY)樣品，精密稱取約1.0000 g。然后分別精密加入一定量的對照品，按1.2.3條件制備供試樣品，再按1.2.1色譜條件進行測定，計算回收率。

1.2.10 樣品含量測定 制備5批余甘子供試樣品：賓川盈玉(BCYY)、賓川卷葉(BCJY)、賓川野生(BCYS)、元謀野生(YMYS)、元江野生(YJYS)溶液，精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，平行測定3次，按1.2.1色譜條件進樣分析，利用標準曲線外標法測定5批供試樣品中沒食子酸的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

分別對比了乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)等度洗脫(體積比為5∶95)、甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)等度洗脫(體積比為5∶95)、乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0～5 min,1%～5%A; 5～25 min,5%～10%A;25～26 min,10%～85%A; 26～35 min,85%～85%A; 35～36 min,85%～1%A;36～46 min,1%～1%A;)3種洗脫方式，發現采用乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)等度洗脫時，峰型無重疊，能分離，保留時間適中，基線平穩，但測試樣品數超過4個以后，因受粘酸及鞣質易吸附在色譜柱上的影響，保留時間提前，影響測試結果的準確性，不適合大批量樣品的準確測定；而采用甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)等度洗脫時，有較多雜峰且峰型重疊嚴重，基線波動大,不適合作為色譜條件；采用乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)進行梯度洗脫時，各峰分離度好、峰型好、保留時間適中、基線平穩，可以進行大批量測試，保留時間不會提前，數據準確。

目前，大部分研究中沒食子酸的檢測波長為273 nm[7]，因此選擇273 nm作為檢測波長，利用乙腈進行梯度洗脫時，一般選擇濃度從1%到85%；0～5 min時，乙腈濃度由1%升到5%；5～25 min時，因沒食子酸的峰位于這段時間內，故乙腈的濃度由5%慢慢升到10%，由圖1可知，所得到的沒食子酸的峰型較好，保留時間適中且各峰分離度好，沒食子酸對照品的保留時間為9.026 min，供試樣品的保留時間為9.037 min，對照品和供試樣品的保留時間基本一致，說明利用50%的丙酮溶液浸漬12 h，超聲提取90 min后可將余甘子中的沒食子酸提取出來；25～26 min時，因所需的沒食子酸的峰已出現，為沖洗色譜柱中的殘留樣品，排除粘酸和鞣質易吸附在色譜柱上的影響，在1 min時間內將乙腈的濃度由10%升高到85%，為利用高濃度有機相乙腈沖洗色譜柱做好準備；在26～35 min時間內，利用高濃度85%的乙腈沖洗色譜柱，使上一針的殘留樣品被沖洗掉，同時粘酸和鞣質也被沖洗掉，防止粘酸和鞣質吸附在色譜柱上；在35～36 min的1 min時間內，乙腈的濃度由85%降到1%，為平衡高效液相色譜儀中有機相乙腈的濃度為1%做好準備；36～46 min時間內，利用濃度為1%的乙腈平衡高效液相色譜儀中的溶劑濃度10 min，恢復剛開始分析時乙腈-磷酸水溶液的濃度。通過利用乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，不僅得到了所需的沒食子酸的峰，還使上一針的殘留樣品被沖洗掉，同時防止粘酸和鞣質吸附在色譜柱上，最后還平衡了高效液相色譜儀中的溶劑濃度，恢復剛開始分析時乙腈-磷酸水溶液的濃度。利用梯度洗脫的方式無需手動清洗色譜柱，一次性設置可自動清洗，節約時間，還可測定大批量余甘子樣品，極大地優化了色譜條件。

2.2 線性關系考察

由表2可知，以沒食子酸對照品溶液的濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=18936x-20.002，R2=0.9999(n=7)。結果表明，沒食子酸在0.015～3.500 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。檢出限為0.01468 μg/mL，檢出限較低，說明此方法的靈敏度較高。

圖1 沒食子酸對照品(a)和供試樣品(b)的高效液相圖譜

表2 沒食子酸的線性回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限

2.3 精密度、穩定性、重復性

通過對沒食子酸對照品連續進樣6次，測得沒食子酸峰面積的RSD為0.23%，說明儀器的精密度良好；將賓川盈玉(BCYY)提取液放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，測得沒食子酸峰面積的RSD為1.03%(n=6)，說明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定性良好；取供試樣品賓川盈玉(BCYY)，供試品中提取的沒食子酸峰面積的RSD為0.81%，表明該方法的重復性良好。

2.4 加標回收率實驗

由表3可知，沒食子酸的回收率為98.53%～101.98%，平均加標回收率為100.21%，相對標準偏差(RSD)為1.45%，表明該方法的準確度較高，能夠滿足實驗測定的需要。

表3 沒食子酸的加標回收實驗結果(n=6)

2.5 樣品含量測定

利用標準曲線外標法分別測定了5批余甘子樣品中沒食子酸的含量(表4)，結果表明：賓川盈玉(BCYY)中沒食子酸的含量最高，含量高達3.1972±0.1900 mg/g；元江野生(YJYS)余甘子中沒食子酸含量為0.7098±0.1750 mg/g，與賓川卷葉(BCJY)余甘子中沒食子酸的含量相差不大，賓川卷葉(BCJY)余甘子中沒食子酸的含量為0.6687±0.2200 mg/g；元謀野生(YMYS)余甘子中沒食子酸的含量為0.4251±0.0990 mg/g；沒食子酸含量最低的是賓川野生(BCYS)余甘子，含量僅為0.2166±0.1040 mg/g。干熱河谷地區各地余甘子中沒食子酸含量各不相同，其中賓川盈玉(BCYY)余甘子中沒食子酸的含量高達3.1972±0.1900 mg/g，是賓川野生(BCYS)余甘子含量的15.0倍，而沒食子酸又是余甘子中的主要活性成分，說明賓川盈玉(BCYY)余甘子在藥用方面具有較大的應用價值。

表4 余甘子樣品中沒食子酸含量的測定結果(n=3)

3 討論

本研究中選擇273 nm作為檢測波長，發現沒食子酸在該波長處吸收相對較大、雜質干擾少、各峰分離度好、保留時間適中，現有大部分參考文獻中均選用273 nm作為沒食子酸的最佳檢測波長[7,15]。現研究常采用不同濃度的甲醇(常用濃度為50%的甲醇)[8]提取余甘子中的沒食子酸，通過對比50%的乙醇、50%的甲醇和50%的丙酮的提取率，發現50%的丙酮的提取率更高，因此選擇濃度為50%的丙酮作為提取溶劑，為充分提取出余甘子中的沒食子酸，在超聲提取前先浸漬12 h。沒食子酸的提取多采用溶劑回流提取[16]、超聲波提取[17]和微波提取[18]3種方法，這些方法均可把活性成分提取出來。其中超聲波提取的原理是利用超聲波對溶劑和樣品的聲空化作用將樣品擊碎，使樣品與溶劑充分接觸，提高傳質速率，從而將活性成分提取出來，因超聲波提取具有快速、高效等優點，得到了廣泛的應用[19]，本研究就是利用超聲波將余甘子中的活性成分沒食子酸提取出來。

相比于乙腈-0.2%磷酸水溶液等度洗脫和甲醇-0.2%磷酸水溶液等度洗脫，本文選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫，結果沒食子酸的峰型較好、分離度好、保留時間適中且理論塔板數高，供試樣品中沒食子酸的保留時間為9.037 min，沒食子酸對照品的保留時間為9.026 min，重現性較好；利用等度洗脫時，峰型重疊嚴重，分離度差，但利用梯度洗脫可以解決峰型重疊、分離度差等問題。鞣質和粘酸與余甘子的成熟度相關，因在相同時期采摘不同產地的余甘子樣品，受各種生態因子(溫度、海拔、光照、濕度)、品種、產地、栽培方式等的影響，會導致余甘子樣品的成熟度不一致，在余甘子未完全成熟前，含有大量的鞣質和粘酸，隨著成熟度的增加，鞣質和粘酸逐漸降解，沒食子酸的含量相對增加[11-13]，且余甘子果肉中富含鞣質，含量高達11.4%[14]，說明余甘子中除了沒食子酸外還含有一定量的鞣質和粘酸，而鞣質和粘酸易吸附在色譜柱上，若采用等度洗脫，測試次數不大于4次時不會有太大的影響，當進行大批量測試時，易導致保留時間提前，出峰時間受到影響，從而影響實驗結果的準確性，因此采用乙腈-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫，各峰分離度好、峰型好、保留時間適中、基線平穩，且可以大批量測試，數據結果準確。

沒食子酸是余甘子中的主要藥用活性成分，現代藥理研究表明沒食子酸具有清除自由基、抗菌消炎、抗氧化、抗突變、降血脂、保肝、抗腫瘤等作用，同時是生物體內參與生產酯鍵的最頻繁的有機酸類[7]。沒食子酸是多元酚類化合物的主要成分[20]，多元酚類在余甘子中含量較高，多元酚類是電子或氫供體，因具有酚類游離基中間體的共振非定域作用和沒有適合分子氧進攻的位置，所以比較穩定，不會引起新的游離基或者因鏈反應而被迅速氧化[21]，因此具有抗氧化作用。干熱河谷地區具有大量的余甘子，沒食子酸的較強抗氧化作用在醫藥方面具有較大的開發利用價值。

通過對5個不同批次的余甘子樣品中沒食子酸含量進行測定，結果賓川盈玉(BCYY)、賓川卷葉(BCJY)、賓川野生(BCYS)、元謀野生(YMYS)、元江野生(YJYS)余甘子中沒食子酸含量分別為3.1972±0.1900、0.6687±0.2200、0.2166±0.1040、0.4251±0.0990、0.7098±0.1750 mg/g，干熱河谷地區各地余甘子中沒食子酸含量各不相同，其中賓川盈玉(BCYY)中沒食子酸的含量最高，而元江野生(YJYS)余甘子中沒食子酸含量和賓川卷葉(BCJY)余甘子中沒食子酸的含量相差不大，元謀野生(YMYS)余甘子中沒食子酸的含量略高于賓川野生(BCYS)余甘子，賓川野生(BCYS)余甘子中沒食子酸的含量最低，不同產地余甘子的含量存在一定的差異，這可能與當地的自然條件、土壤、人工種植、采摘時間等因素有關，有待進一步研究[22]。