玉木耳轉錄組測序及褐變相關基因的挖掘

楊和川，蘇文英，譚一羅，周振玲，秦裕營，李 曉

(1.江蘇省連云港市農業(yè)科學院,江蘇 連云港 222006；2.吉林農業(yè)大學 食藥用菌教育部工程中心,吉林 長春 130118)

玉木耳,是毛木耳(Auriculariacornea)的白色變種[1]。色澤是衡量玉木耳商品價值的重要指標之一,理想的商品玉木耳要求采摘后外形好、顏色潔白。然而玉木耳有一個大的缺陷,采收后的玉木耳如果晾曬不及時,則極易發(fā)生褐變。玉木耳一旦褐變,則被視為鮮度下降,嚴重影響玉木耳的食用價值和商品價值。研究表明,在食用菌中催化子實體褐變過程的主要酶類為多酚氧化酶(PPOs)和氧化酶類,多酚氧化酶主要是指酪氨酸酶、雙酚氧化酶、漆酶等[2]。目前,對雙孢蘑菇組織褐變的研究表明,多酚氧化酶是其發(fā)生酶促褐變的主要原因[3]。此外,也有研究表明漆酶基因在香菇黑色素形成過程中發(fā)揮重要作用[2]。近年來,利用分子生物學技術對食用菌組織褐變機制的研究越來越多。因此,利用轉錄組測序技術和生物信息學方法,從轉錄組水平比較不同材料的轉錄譜差異,解析玉木耳褐變的代謝途徑和信號轉導等調控機制,發(fā)掘、鑒定和克隆關鍵節(jié)點的功能基因/調控元件,對食用菌抗褐變分子育種具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本項目組于2018年6月14日在連云港市錦屏鎮(zhèn)玉木耳種植大棚內發(fā)現(xiàn)同一批制種栽培、同一生長環(huán)境下的玉木耳子實體有一部分發(fā)生了褐變，因此將未褐變的子實體作為對照組,將褐變的子實體作為實驗組從成熟菌袋摘取,立即存入液氮中,運回實驗室后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 總RNA的提取、cDNA文庫構建及轉錄組測序

按TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取總RNA,通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA是否有污染及降解;利用Nanodrop檢測RNA的純度(以OD260/OD280≥1.8為標準);應用自動生物分析系統(tǒng)Agilent 2100精確檢測待測序樣品RNA的完整性。在樣品檢測合格后進行cDNA文庫構建及RNA-Seq轉錄組測序(由北京諾禾致源科技股份有限公司完成)。

1.3 序列組裝

將測序獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)中含有帶接頭的、重復的和測序質量很低的Reads過濾,得到高質量的Clean reads。采用Trinity對Clean reads進行拼接,通過Corset層次聚類得到最長的Cluster序列，進行后續(xù)的分析。

1.4 基因注釋

為了獲得全面的基因功能信息,將組裝獲得的Unigene序列與七大數(shù)據(jù)庫(NR、NT、KOG、Swiss-Prot、KO、GO、PFAM)進行比對(evalue<0.00001),獲得功能注釋。

1.5 差異表達基因分析

使用FPKM (Fragments per kb per million fragments)法表示Unigene表達量[4]。采用DESeq2[5]進行基因差異表達分析,篩選閾值為padj<0.05且|log2FoldChange|>1。然后,通過對差異表達基因進行GO和KEGG功能富集分析,篩選與玉木耳子實體褐變相關的差異表達基因 。

1.6 qRT-PCR驗證測序結果

隨機選擇測序篩選得到的7個表達顯著差異的基因,進行qRT-PCR驗證分析,所用引物通過Primer Primer 5軟件設計(表1)。以褐變前、后的玉木耳子實體RNA為模板,反轉錄獲得cDNA, 以ACTIN基因為內參基因。采用SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit (TaKaRa)熒光定量試劑盒在ABI StepOne Plus型熒光定量PCR儀上進行熒光定量檢測。擴增條件:95 ℃ 30 s,循環(huán)1次;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,循環(huán)40次；72 ℃單點檢測信號。每個樣品設3 次技術重復,采用 2-△△Ct法對各基因進行相對定量分析。

表1 qRT-PCR的引物

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數(shù)據(jù)組裝及統(tǒng)計

通過對未褐變及褐變玉木耳子實體轉錄組進行轉錄組測序,共獲得Clean Bases 30.26 G, Q30堿基百分比在92%以上,G、C含量在62%以上(表2),可以用于下一步組裝。利用Trinity 組裝后共獲得128120條Unigene序列,總長度為173216508個核苷酸,平均長度為957 bp,N50 長度為1834 bp。Unigene的序列長度主要分布在200～2000 bp;其中500～2000 bp間的序列數(shù)量較多,約占全部序列的64.6%,表明獲得的測序數(shù)據(jù)及組裝質量可靠性較高,可以進行后續(xù)分析(圖1)。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計結果

圖1 玉木耳Unigene長度分布

2.2 轉錄組Unigene的功能注釋

將獲得的Unigene分別注釋到NR (NCBI non-redundant protein sequences)、NT (NCBI nucleotide sequences)、PFam (Protein family)、KOG(euKaryotic Ortholog Groups)、COG (Cluster of orthologous groups)、Swiss-Prot (Swiss-Prot protein database)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、GO (Gene Ontology)。結果顯示,有50.7%的Unigene可以獲得功能注釋(表3)。其中,64.75%的Unigene被注釋到NR數(shù)據(jù)庫中。而在注釋類別中, KEGG的注釋量為33832條,占總注釋的26.4%。

表3 功能注釋結果統(tǒng)計

2.3 Unigene的功能注釋和分類

通過對獲得的78979個Unigene基因進行GO功能顯著性富集分析,發(fā)現(xiàn)總共涉及56種生物功能,分別劃分為生物學過程、細胞組分和分子功能。這3類功能可分別進一步細化為26、20和10個亞類(圖2)。在生物學過程中,占比最多的Unigene為參與細胞過程和代謝過程,分別占59.2% (46742個)和56.5% (44593個)；此外,單一有機體也屬于顯著富集的類型,共包含34277個Unigene,占比為43.4% (圖2)。在細胞組分分類中,細胞和細胞組分類型中的Unigene最多,占33.6% (26513個)；細胞器和大分子復合體次之,占比分別為24.1% (19051個)和23.5%(18566個) (圖2)。在分子功能分類中,占比較高的Unigene為結合作用和催化活性,分別占57.2% (45174個)和46.0% (36307個);最后是結構分子活性和轉運活性,所占比例分別為7.7% (6107個) 和7.3%(5775個)(圖2)。

對33832個Unigene基因進行KEGG Pathway富集分析,結果表明33832個Unigene比對到32條信號通路。顯著富集KEGG途徑可分為5類,這5類途徑包括細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝以及有機系統(tǒng)。其中,最主要的信號通路為翻譯通路,共有8217個Unigene參與,約占Unigene總量的24.3%;其次,4409個Unigene參與信號轉導途徑,所占比例為13.0%;再次,分別為內分泌系統(tǒng)、折疊排序及退化、運輸和分解代謝通路等(圖2)。

2.4 差異表達基因KEGG富集分析

對篩選獲得的差異表達基因進行統(tǒng)計分析,結果發(fā)現(xiàn)共存在5915個差異基因,其中有924個Unigene上調表達,有4991個Unigene下調表達。將差異表達基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對,有2587條差異基因得到注釋,富集在99條KEGG代謝通路中。富集最多的KEGG通路為核糖體、內質網(wǎng)蛋白加工、吞噬體等(圖3),其中注釋為核糖體的差異表達基因數(shù)量最多,為683個,占代謝通路中全部差異表達基因數(shù)的11.54%,其中上調表達基因589個,下調表達基因94個。在99個代謝通路中,推測酪氨酸代謝途徑(ko00350)可能與玉木耳組織褐變相關。絡氨酸代謝途徑中酪氨酸酶基因Cluster-50942.40979 [TYR, tyrosinase (EC:1.14.18.1)]在食用菌組織褐變中發(fā)揮重要作用。

1. behavior; 2. biological adhesion; 3. biological phase; 4. biological regulation; 5. cell aggregation; 6. cell killing; 7. cellular component organization or biogenesis; 8. cellular process; 9. detoxification; 10. developmental process; 11. growth; 12. immune system process; 13. localization; 14. locomotion; 15. metabolic process; 16. multi-organism process; 17. multicellular organismal process; 18. negative regulation of biological process; 19. positive regulation of biological process; 20. regulation of biological process; 21. reproduction; 22. reproductive process; 23. response to stimulus; 24. rhythmic process; 25. signaling; 26. single-organism process; 27. cell; 28. cell junction; 29. cell part; 30. extracellular matrix; 31. extracellular matrix component; 32. extracellular region; 33. extracellular region part; 34. macromolecular complex; 35. membrane; 36. membrane part; 37. membrane-enclosed lumen; 38. nucleoid; 39. organelle; 40. organelle part; 41. other organism; 42. other organism part; 43. synapse; 44. synapse part; 45. virion; 46. virion part; 47. antioxidant activity; 48. binding; 49. catalytic activity; 50. metallochaperone activity; 51. molecular function regulator; 52. molecular transducer activity; 53. nucleic acid binding transcription factor activity; 54. structural molecule activity; 55. transcription factor activity, protein binding; 56. transporter activity.

圖2 差異表達基因GO功能分類

2.5 轉錄組的實時熒光定量PCR驗證

為了驗證轉錄組測序結果的可靠性,從轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出影響褐變的關鍵基因7個,以ACTIN基因為內參基因,對這些差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證，結果見表1。對獲得的qRT-PCR數(shù)據(jù)和轉錄組測序數(shù)據(jù)做相關性分析,結果發(fā)現(xiàn)7個差異基因的表達趨勢與轉錄組分析結果的表達趨勢基本相同,證明了轉錄組測序獲得的基因表達信息是可靠的(圖4)。

圖4 不同階段差異基因的熒光定量PCR檢測結果

3 討論

基于轉錄組高通量測序技術,本研究對褐變前、后的玉木耳子實體進行了轉錄組測序,共獲得數(shù)據(jù)30.26 G。對篩選獲得的差異表達基因進行統(tǒng)計分析,結果表明共存在5915個差異基因,其中有924個Unigene上調表達,有4991個Unigene下調表達。這些差異表達的基因可能直接或間接影響玉木耳子實體的褐變。例如,在絡氨酸代謝途徑(ko00350)中酪氨酸酶基因推測與玉木耳褐變有關。酪氨酸酶[TYR, tyrosinase (EC:1.14.18.1)]是一種雙核含銅酶,一般也稱為多酚氧化酶,在生物體合成黑色素過程中起關鍵作用[6]。酪氨酸酶主要在L-dopa途徑中發(fā)揮作用,其催化單酚化合物酪氨酸羥化形成二元酚即3,4-二羥基苯丙氨酸,之后進一步被氧化形成多巴醌,多巴醌再經(jīng)一系列反應后,最終生成黑色素[7]。1974年,Turner等提出了酪氨酸酶基因在雙孢蘑菇黑色素的合成中可能發(fā)揮相當重要的作用[8]。彭博等通過對不同貯藏時期的雙孢蘑菇進行轉錄組測序,篩選出PPO1、PPO3、PPO5等5個可能與雙孢蘑菇子實體褐變相關的多酚氧化酶基因[9]。楊亦農等利用基因編輯技術對雙孢蘑菇中的多酚氧化酶基因進行編輯,使該酶的活性降低了30%,使雙孢蘑菇更抗褐變[10]。此外,褐變子實體中漆酶基因(Cluster- 50942.6597)的表達量顯著上調。漆酶(Lac, Laccase, EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,歸類于藍色多銅氧化酶家族(MCO),能夠催化氧氣還原成水,并將酚類物質或者多酚類物質轉化成對應的醌[11]。漆酶基因在香菇中被研究最多,目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有10個香菇漆酶基因序列。研究表明,在香菇子實體衰老的后期,漆酶基因lcc2、lcc4的表達量較高,并伴隨著香菇細胞壁的溶解以及菌褶的轉色,推測這些基因在香菇黑色素形成過程中發(fā)揮了一定的作用[12-16]。以上這些研究結果為后期進一步分析差異基因與玉木耳組織褐變的調控關系提供了初步的理論參考和依據(jù)。