斜紋夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表達分析

孫 楊,陳 瓊,2,胡妍月,秦文婧,黃水金*

(1.江西省農業科學院 植物保護研究所,江西 南昌 330200;2.江西省自然資源廳 國土資源勘測規劃院,江西 南昌 330025;3.江西省農業科學院 土壤肥料與資源環境研究所,江西 南昌 330200)

0 引言

精氨酸激酶(arginine kinase, AK),是無脊椎動物體內主要的磷酸原激酶。它通過催化精氨酸與ATP之間的可逆反應,將能量儲存于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中,或將磷酸精氨酸分解產生ATP,從而對無脊椎動物體內的能量代謝、儲存和利用起關鍵的調節作用。有研究表明,精氨酸激酶不僅在肌肉中大量存在,也存在于能量需求較大的腦、觸角和復眼中[1],并且在沙漠蝗(Schistocercagregaria)的后腸[2]及煙草天蛾(Manducasexta)的中腸里也發現了高活性的精氨酸激酶參與上皮細胞中的離子運輸[3]。此外精氨酸激酶能與肌動蛋白結合,與動物的運動存在密切關系[4]。迄今,已有甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)等10多種昆蟲的精氨酸激酶基因被克隆。

斜紋夜蛾[Spodopteralitura(Fab.)]是一種世界性分布的重要農業害蟲。它的寄主植物已知有109科389種,尤以棉花、煙草、大豆、玉米和甘藍等作物受害最重[5-6]。近年來,由于化學農藥的大量使用,斜紋夜蛾對多種殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性[7-9]。多數常規藥劑對斜紋夜蛾的防治效果顯著下降,已不能有效控制其為害[10]。為此,本研究在克隆斜紋夜蛾精氨酸激酶基因的基礎上,對其分子特征及組織和發育時期的表達特性進行了分析,以期為農業生產中尋找合理的害蟲防治方法提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲

斜紋夜蛾卵塊由南京農業大學昆蟲生理與分子生物學實驗室友情贈送,卵塊孵化后幼蟲用人工飼料飼養；飼養溫度為26 ℃,光周期為16L∶8D。在蛹期分雌雄分別飼養,待羽化后將雌雄配對放入養蟲籠內,養蟲籠內四壁貼有白紙,上蓋紗布,以供成蟲產卵。在籠內喂以10%蜂蜜水。

1.2 試劑和試劑盒

總RNA提取試劑UNIQ-10購自上海生工；反轉錄Quantscript RT Kit Quant cDNA購自天根生物科技有限公司； Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD-18T載體、3′RACE Kit、SYBP Premix EX TaqTM(Perfect Real Time)等購自大連寶生物工程有限公司；PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自BBI。

1.3 斜紋夜蛾AK基因全長cDNA的克隆

1.3.1 總RNA提取和第一鏈cDNA的合成 取3齡斜紋夜蛾幼蟲的中腸,用液氮研磨后采用Trizol法提取總RNA,并反轉為第一鏈cDNA。

1.3.2 AK基因片段的克隆 參考GenBank中已登錄的甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GenBank:GQ379235)、煙芽夜蛾Heliothisvirescens(GenBank:GU726905)的AK基因序列,設計簡并引物SlAKF1和SlAKR1(表1)。以第一鏈cDNA為模版進行擴增,反應參數為:94 ℃預變性5 min;然后94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個循環;最后72 ℃延伸10 min。擴增的PCR產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,PCR產物經純化試劑盒純化后連接到pMD-18T載體中,轉化DH5α感受態細胞；挑取陽性克隆經酶切鑒定后進行測序分析,測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.3.3 3′RACE擴增 采用Trizol法提取總RNA,用DNaseⅠ消化痕量DNA,根據試劑盒說明書合成SMART cDNA模版,設計合成基因特異性引物SlAKF2和SlAKF3，與試劑盒中的3′下游引物進行巢式PCR。反應參數為:94 ℃預變性5 min;然后94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25個循環;最后72 ℃延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收PCR產物。純化、克隆擴增產物，然后進行序列測定，具體步驟見1.3.2。

1.3.4 序列分析與系統進化樹的構建 序列分析采用生物信息學在線工具(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)；Blast相似性搜索在NCBI網站進行,用Clustal W和GeneDoc軟件進行多序列比對；利用MAGE 4.0軟件中的鄰接法構建系統進化樹。

1.4 斜紋夜蛾AK基因表達的定量分析

1.4.1 斜紋夜蛾AK基因在幼蟲不同組織中的表達 分別取進入5齡第二天幼蟲的頭部、中腸、表皮和脂肪體,提取總RNA,反轉錄后進行實時熒光定量PCR反應(以Actin基因為內參)。PCR擴增條件為:94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環。重復3次。

1.4.2 斜紋夜蛾AK基因在幼蟲不同發育時期的表達 分別取進入1齡、2齡、3齡、4齡、5齡、6齡蛻皮第二天的斜紋夜蛾幼蟲,提取總RNA,反轉錄后進行實時熒光定量PCR反應,方法同1.4.1,重復3次。

1.4.3 數據統計處理 采用2-△△CT方法進行實驗數據的統計處理,△CT=CT目的基因-CT內參基因;△△CT=△CT試驗組-△CT對照組[11]。根據所得數據作柱狀圖,并計算標準誤。

表1 引物設計

2 結果與分析

2.1 斜紋夜蛾AK基因的克隆

利用簡并引物SlAKF1/SlAKR1通過PCR擴增AK基因的目的片段,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶(圖1A),其長度為1345 bp。經BLAST分析,此序列與甜菜夜蛾等昆蟲精氨酸激酶基因的同源性達96%。因此將該基因命名為斜紋夜蛾精氨酸激酶基因SlAK。進而通過RACE技術獲得了326 bp的3′端序列(圖1B)。最后經拼接獲得了斜紋夜蛾AK基因的全長cDNA序列(圖2, GenBank登錄號為HQ840714)。如圖2所示,該基因全長為1373 bp,5′和3′UTR的長度分別為65和240 bp,在3′UTR區有1個加尾信號AATAA以及18 bp的poly(A)尾巴；其開放閱讀框位于66～1133 bp,編碼355個氨基酸。位于SlAK氨基酸序列中的高度保守的7個氨基酸CPTNLGT(270～276)是精氨酸激酶的活性中心部位序列,其中第270位的半胱氨酸(C)是AK所必需的酶活性位點；第61位的天冬氨酸(Asp)與第192位的精氨酸(Arg)可以形成離子耦合結構,該離子耦合結構對精氨酸激酶的活性具有重要作用。

M1:DNA分子量標準DNA marker DL2000; 1:部分序列PCR產物; M2:DNA分子量標準DNA marker DL1000; 2:3′RACE產物。

圖中方框示酶活性中心氨基酸序列；雙下劃線示加尾信號。

2.2 斜紋夜蛾與其它昆蟲AK序列的比對

AK的氨基酸序列高度保守。由圖3可見,斜紋夜蛾SlAK與其他昆蟲AK的氨基酸序列的同源性達80%以上,與近緣種煙芽夜蛾的同源性高達99%(350/355 aa),與甜菜夜蛾的同源性為98%(348/355 aa)。

SaAK:美洲沙漠蝗Schistocercaamericana(U77580); LmmAK:東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(DQ513322); PaAK:美洲大蠊Periplanetaamericana(GU301882); HvAK:煙芽夜蛾Heliothisvirescens(GU726905); HaAK:棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(GU396008); SlAK:斜紋夜蛾Spodopteralitura(HQ840714); SeAK:甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GQ379235); PiAK:印度谷螟Plodiainterpunctella(AJ315030); PxAK:小菜蛾Plutellaxylostella(HQ327310); BmAK:家蠶Bombyxmori(FJ013046); PsAK:黃曲條跳甲Phyllotretastriolata(EU420057); DmAK:黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NM_168313)。

圖3 斜紋夜蛾AK與其他昆蟲AK氨基酸序列的比對

將斜紋夜蛾AK氨基酸序列與部分已知的其他昆蟲AK氨基酸序列進行比對后構建進化樹,結果如圖4所示。鱗翅目昆蟲AK共聚一支,其中斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的AK親緣關系最近,并與煙芽夜蛾及棉鈴蟲位于同一分支上,這與它們在分類地位上的親緣關系遠近是一致的。

2.3 斜紋夜蛾AK基因在幼蟲不同組織內的表達

SlAK基因在斜紋夜蛾幼蟲不同組織內的表達結果如圖5所示。在頭部、中腸、體壁、脂肪體中均有表達。以體壁CT中的表達量為1,中腸表達量約為33.8倍,表達量最高;其次是頭部與脂肪體,表達量分別為10.9倍和13.8倍。

所用氨基酸序列與圖3相同。

HD:頭; MD:中腸; FB:脂肪體; CT:體壁。

2.4 斜紋夜蛾AK基因在幼蟲不同發育時期的表達

SlAK基因在斜紋夜蛾幼蟲不同發育時期中腸內的相對表達水平如圖6所示。SlAK在幼蟲2齡的表達量最低；以在幼蟲2齡的表達量為參照(設為1)，在幼蟲3齡時期的SlAK表達量達到最高，為33.4倍，這可能與3齡期幼蟲的能量代謝旺盛有關；在其余各齡期的表達量最高不超過5倍。

圖6 SlAK基因在斜紋夜蛾幼蟲不同發育時期的相對表達水平

3 小結與討論

精氨酸激酶(AK)廣泛存在于無脊椎動物中,為生命活動提供能量,并維持體內ATP的平衡。本研究采用RT-PCR和RACE技術獲得了斜紋夜蛾1373 bp的SlAK基因全長cDNA序列,并利用熒光定量PCR技術測定了精氨酸激酶基因在斜紋夜蛾幼蟲不同組織和不同發育階段的表達情況。結果表明精氨酸激酶基因為組成型表達,在斜紋夜蛾幼蟲的中腸內相對表達量最高,其次是在脂肪體內的表達量,而在體壁內的表達量最低。這與精氨酸激酶基因在煙夜蛾(Helicoverpaassulta)[12]、煙草天蛾[5]中腸中的高表達一致。此外,王華兵等發現AK在家蠶脂肪體中的表達量較高[13]；而在凡納濱對蝦表皮中的AK表達量最低[14]。這些結果表明精氨酸激酶基因的表達量與組織細胞的代謝活性密切相關。

精氨酸激酶基因在昆蟲不同發育時期有不同表達。王華兵等研究發現家蠶精氨酸激酶基因在幼蟲期的表達量隨齡期增長而逐漸增加，且均高于蛹期[13]；張元臣等(2011)對煙夜蛾幼蟲4、5齡期及蛹期脂肪體的精氨酸激酶基因的表達量進行了研究，發現在預蛹期的表達量達最高峰,其次為4齡,而在5齡的表達量一直處于較低水平[12]。本研究僅對斜紋夜蛾幼蟲不同發育時期的精氨酸激酶基因的表達量進行了檢測,發現在3齡幼蟲期的表達量達最高峰,這可能與斜紋夜蛾3齡幼蟲從聚集取食轉向分散取食而需要的能量加劇有關,具體原因待進一步探明。

精氨酸激酶僅存在于無脊椎動物中,該酶及其磷酸原的能量代謝途徑與哺乳動物中的完全不同[15-17],因此精氨酸激酶可以作為控制昆蟲的一個很好的靶標,高效無毒且環境友好[18]。一些精氨酸激酶抑制劑先后被用于對酶活性和對害蟲的影響研究[19--20]。Zhao等研究發現,給黃曲條跳甲(Phyllotretastriolata)成蟲喂食精氨酸激酶基因dsRNA能導致黃曲條跳甲生育力下降和死亡[18]。因此,精氨酸激酶基因作為新的害蟲控制靶標,有助于發展新的害蟲控制藥劑,在害蟲防治中發揮重要作用;而基于精氨酸激酶基因的RNA干擾技術是否可用于斜紋夜蛾的防治值得進一步的研究。