蜚蠊目RNA干擾的應用研究進展及展望

馬云峰 李紹斌 楊松 黎玄鋼

摘 要蜚蠊目昆蟲的一些成員是世界公認的害蟲，嚴重影響人類生活健康，采用RNA干擾（RNAi）技術可以減少蜚蠊目昆蟲的數量以及疾病的傳播。RNA干擾是外源性或內源性雙鏈RNA經過Dicer酶加工處理為小干擾RNA（siRNA）與標靶基因結合，使相應標靶基因沉默的現象，從而阻止某一基因功能在細胞或整體水平上的表達，具有高效性和特異性等優勢。RNAi技術作為研究基因功能的研究工具被廣泛運用，并顯示出開發新型有害生物管理策略的巨大潛力。近年來，此技術已被廣泛成功應用于多種昆蟲中，目前為止，只有較少文獻關于蜚蠊目昆蟲RNAi的報道。本文綜述了RNAi在蜚蠊目中的應用研究進展，并展望了今后的研究方向。

關鍵詞蜚蠊目;基因;RNA干擾;雙鏈RNA;研究進展

0 前言

蜚蠊俗稱蟑螂，屬于昆蟲綱（Insecta）、蜚蠊目（Blattaria），其中一些種類在醫學與經濟方面有巨大的危害性，它是世界性衛生害蟲，包括美洲大蠊（Periplaneta americana）、澳洲大蠊（Periplaneta australasiae）、東方蟑螂（Blatta orientalis）、德國小蠊（Blattaria germanica），能夠機械性傳播多種致病菌，如痢疾桿菌、沙門桿菌、變形桿菌和寄生蟲卵等病原體，是人類諸多疾病的傳播媒介;其排泄物和蛻落的表皮可能會帶有過敏原，從而引起過敏性疾病的發生[1]。

1 RNAi抑制蜚蠊產卵及疾病的傳播

作為世界公認的衛生性害蟲之一的蜚蠊[1]，嚴重影響人類生活和健康。蜚蠊類害蟲具有驚人的繁殖速度，導致其種群數量龐大，而且糞便中攜帶七種過敏原[8]，直接暴露與人類的接觸，增加人類發病率。因此，利用RNAi是一種有效控制蜚蠊數量及疾病傳播的方法。有實驗研究表明，蜚蠊糞便中含有過敏原且是蜚蠊體內的Blag 1蛋白起作用[8]，通過注射dsRNA抑制蜚蠊體內Blag 1 mRNA的表達，使蜚蠊消化能力下降，排便較少。經檢測，注射dsRNA的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量遠遠低于對照組的Blag 1 蛋白的含量，且在第6天后，未注射的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量將近注射dsRNA的蜚蠊的9倍[8]，注射dsRNA減少了過敏原的排出，從而降低了與人類接觸的幾率，從而降低人類發病率。注射dsRNA還會影響蜚蠊體內保幼激素的合成量，從而影響蜚蠊的正常發育，而且還會影響卵黃細胞的成熟。注射dsOKs（Double-stranded Orcokinins）會降低OK（Orcokinin）基因mRNA的表達，影響卵母細胞的生長[9]，降低了雌性蜚蠊受精成功率，從而減少蜚蠊的出生率。總的來說，利用RNAi技術能夠有效控制蜚蠊種群數量和疾病的傳播，特別是過敏原的傳播。

2 dsRNA導入蜚蠊體內的方法

目前，對昆蟲的然RNAi技術的研究已比較成熟，將dsRNA導入昆蟲體內普遍使用的方法有注射法和喂食法兩種。

注射法：將體外合成的dsRNA通過微量注射器注射到昆蟲體內，是目前應用最普遍的導入方法。Kennerdell和Carthew用顯微注射的方法將dsRNA注入果蠅胚胎中，實現了用RNAi技術對昆蟲基因功能的研究。繼 RNAi技術在果蠅的成功應用之后，通過人工介導的方式引入dsRNA昆蟲體內，產生缺陷型個體來研究基因的功能已被越來越多的昆蟲學家應用[5]。采用RNAi技術注射dsRNA，抑制蜚蠊目昆蟲相應標靶基因的表達。利用注射的方式向蜚蠊目昆蟲體內導入dsRNA，注射位置通常在第三腹節和第四腹節之間[8]，據其他文獻報道，小蠊的頭部和胸部也可以注射，但只有腹部注射效果最好[9]，原因是注射頭部，頭部神經比較多，容易造成死亡，成功率不高，注射胸部，肌肉過多，不易注射。注射需控制注射量，加入注射量過少，干擾效果不明顯，隨著注射量的增加一定量之前，干擾效果會更加明顯[8]，但超過一定量后，會致死小蠊。但是RNAi產生顯著干擾效果持續時間不長，在一段時間后抑制效果會減弱甚至消失一般在6天或12天[10]。由于德國小蠊血液中含有的少量能夠降解dsRNA的物質[10]，因此，為了注射的dsRNA作用效果更好，采用脂質體將其包裹，注射進入血液循環，更加容易與標靶細胞結合。由于注射法的適用范圍較為限制，只能在實驗室使用，從而可以采用另一種適用范圍較廣的方法-喂食法。

喂食法：根據昆蟲都具有取食的行為特點，科學家使用喂食dsRNA將其導入昆蟲體內。喂食dsRNA操作簡單方便，容易實現，且對昆蟲損失小[6]，因此在大多數情況下，可能是運用范圍較廣且比較普遍適用的一種dsRNA導入方法。通過將dsRNA從小蠊口器中進入食道，小腸上皮細胞吸收dsRNA進入細胞。對昆蟲的相關研究表明，dsRNA的攝取與網格蛋白依賴性內吞作用和巨胞吞作用有關[3]。細胞攝取 dsRNA的機制為系統性RNA干擾缺陷型2（systemic RNA interference defective 2，Sid2）的腸腔內跨膜蛋白的被動轉運，在其中它充當昆蟲中攝入的 dsRNA的內吞受體，進入細胞后，細胞通過網格蛋白依賴性和其他內吞途徑攝取的 dsRNA通過內體轉運到這些細胞質位點，將喂食的dsRNA轉化為 siRNA[3]，讓siRNA與標靶基因接觸，使相應的mRNA沉默。但是由于小蠊中腸中存在能夠分解dsRNA的液體[10]（以下簡稱中腸液），對剛進入食道內的dsRNA及食物一道進行分解，很難讓其進入細胞發揮作用，因此采用一種能夠抗中腸液分解物質-脂質體將其包裹，其進入食道，避免被分解，從小腸上皮細胞進入，從而發揮作用，使mRNA沉默[10]。喂食裸露的和有脂質體包裹的dsRNA，經定量PCR檢測，喂食脂質體包裹的dsRNA有比較高的表達，而喂食裸露的dsRNA幾乎完全被降解[10]。

3 結語和展望