氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定2-氰基溴芐中3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的含量

莊 航

(宿遷市食品藥品檢驗所,宿遷223800)

苯甲酸阿格列汀是以3-甲基-6-氯尿嘧啶和2-氰基溴芐為起始原料,在堿性條件下發(fā)生烷基化反應(yīng)得到2-(6-氯-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氫-2H-嘧啶-1-基甲基)-芐腈,再與(R)-3-氨基哌啶二鹽酸發(fā)生取代反應(yīng)得到(R)-2-[(6-(3-氨基哌啶-1-基)-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2 H)-基)甲基]芐腈(阿格列汀游離堿),阿格列汀游離堿再與苯甲酸成鹽得到苯甲酸阿格列汀[1-5]。由于2-氰基溴芐是合成苯甲酸阿格列汀的關(guān)鍵起始原料[6],其產(chǎn)品的質(zhì)量直接影響苯甲酸阿格列汀的安全性,需要嚴格控制。2-氰基溴芐在合成過程中可能會產(chǎn)生少量的同分異構(gòu)體3-氰基溴芐和4-氰基溴芐副產(chǎn)物[7-8]。2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐均為含鹵代烷烴類結(jié)構(gòu)的基因毒性雜質(zhì),需要對2-氰基溴芐中的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的殘留量進行控制,以降低苯甲酸阿格列汀中基因毒性雜質(zhì)的水平[9-12]。參考ICH M7基因毒性雜質(zhì)評估和控制指導(dǎo)原則中潛在基因毒性雜質(zhì)限度制定依據(jù),以毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC,1.5μg·d－1)法計算[10],苯甲酸阿格列汀的最大日劑量為25 mg,2-氰基溴芐中同類基因毒性雜質(zhì)所允許的最大殘留量為60 mg·L－1。

經(jīng)查詢,國內(nèi)外尚無2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離檢測方法的研究報道。本工作采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)結(jié)合中等極性的毛細管色譜柱同時分離了上述3種化學(xué)性質(zhì)相似的同分異構(gòu)體極性化合物,可快速準確測定2-氰基溴芐中潛在基因毒性雜質(zhì)3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的殘留量,以期為苯甲酸阿格列汀的用藥安全提供保障。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫7890B-7000C型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,配Mass Hunter工作站軟件,XPE56DR型電子天平。

3-氰基溴芐和4-氰基溴芐混合標(biāo)準溶液:分別稱取3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準品各10 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻,配制成1 000 mg·L－1的混合標(biāo)準儲備溶液;移取混合標(biāo)準儲備溶液100μL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混合搖勻,配制成10 mg·L－1的混合標(biāo)準溶液;再移取10 mg·L－1的混合標(biāo)準溶液100μL于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混合搖勻,配制成100μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:稱取試樣約25 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻后,移取1 mL于10 mL容量瓶中,加入100μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準溶液0.3 mL,用乙腈稀釋至刻度,混合均勻。

空白溶液:乙腈。

3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準品的純度均為98.86%;待測樣品中2-氰基溴芐的純度不小于99%;乙腈為色譜級。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 以50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷為固定液的VF-17MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);進樣口溫度為260℃;載氣為氦氣(純度為99.999%),流量為1.5 mL·min－1;碰撞氣為氮氣(純度為99.999%),流量為1.5 mL·min－1;淬滅氣為氦氣(純度為99.999%),流量為2.25 mL·min－1;進樣量為 1μL;襯管為 5190-2295型分流襯管;進樣口為多模式進樣口;分流進樣,分流比為5∶1。柱升溫程序:初始溫度為60℃;以20℃·min－1的速率升溫至180℃;再以5℃·min－1的速率升溫至185℃,保持2 min;最后再以40℃·min－1的速率升溫至300℃,保持2 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;氰基溴芐的定性離子對的質(zhì)荷比m/z為116/63,116/116,碰撞能量分別為35,10 e V;定量離子對的質(zhì)荷比m/z為116/89,碰撞能量為15 e V。

1.3 試驗方法

稱取待測樣品25 mg,用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用乙腈定容,混合均勻,得到待測樣品溶液。移取待測溶液1μL,按照儀器工作條件對其進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

3種氰基溴芐均為沸點較高的極性化合物,試驗首先考慮采用弱極性的HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.320 mm,0.25μm)對2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐進行分離,為了縮短分析時間,色譜柱升溫程序設(shè)定為:初始溫度為60℃,維持3 min,再以20℃·min－1的速率升溫至170℃,保持5 min。載氣流量為1.5 mL·min－1,分流進樣,分流比為20∶1。向待測樣品中加入3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準溶液,按照上述儀器工作條件對其進行測定,色譜圖見圖1。

圖1 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在HP-5毛細管色譜柱下的分離色譜圖Fig.1 Separation chromatogram of 2-cyanobenzyl bromide,3-cyanobenzyl bromide and 4-cyanobenzyl bromide under HP-5 capillary column

結(jié)果表明:4-氰基溴芐和3-氰基溴芐對應(yīng)的相鄰色譜峰的分離度為1.35,小于1.5,說明未實現(xiàn)基線分離。

試驗進一步采用DB-5HT毛細管色譜柱(30 m×0.250 mm,0.1μm)對2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐進行分離,該色譜柱經(jīng)交聯(lián)、鍵合,對高沸點組分可提供更快速的洗脫效率和更好的分離效果。色譜柱升溫程序設(shè)定為:初始溫度為45℃,保持3 min;以20℃·min－1的速率升溫至120℃,保持5 min;再以30℃·min－1的速率升溫至210℃,保持1 min。按照上述儀器工作條件對2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準溶液和供試品溶液進行測定,結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐對應(yīng)的相鄰色譜峰的分離度提高至1.9,大于1.5,實現(xiàn)了基線分離,但是在2-氰基溴芐供試品溶液中4-氰基溴芐和3-氰基溴芐出峰與2-氰基溴芐部分重合,導(dǎo)致該色譜條件下,4-氰基溴芐和3-氰基溴芐的回收率高于150%。

考慮到2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐均為含氰基極性基團的化合物,試驗選擇將弱極性毛細管柱更換為中等極性固定液的毛細管柱,以增加固定液與三者的偶極作用。以VF-17MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)為分析柱,在1.2節(jié)處的柱升溫程序下進行測定,結(jié)果顯示3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離度可達2.8,表明VF-17MS分離效果高于另外兩種弱極性毛細管柱,色譜圖見圖2。

圖2 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在VF-17MS毛細管色譜柱下的分離色譜圖Fig.2 Separation chromatogram of 2-cyanobenzyl bromide,3-cyanobenzyl bromide and 4-cyanobenzyl bromide under VF-17MS capillary column

2.1.2 柱溫

以VF-17MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)為分析柱,在0～20 min內(nèi),色譜柱的溫度先由50℃升溫至300℃,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐、4-氰基溴芐的出峰時間分別為8.126,8.451,8.527 min(見圖3,圖3中柱升溫程序A:0～20 min內(nèi),溫度由50℃升溫至300℃;柱升溫程序B:初始溫度60℃,以20℃·min－1的速率升溫至180℃;再以5℃·min－1的速率升溫至185℃,保持2 min;最后以40℃·min－1的速率升溫至300℃,保持2 min)。VF-17MS毛細管色譜柱的死時間為1.470 min,扣除死時間后得到化合物的調(diào)整保留時間分別為6.656,6.981,7.057 min,該時間對應(yīng)的柱溫箱溫度即為該化合物的特征流出溫度,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐、4-氰基溴芐的特征流出溫度分別為183.12,189.62,191.14℃。因為氣相色譜儀采用氣浴加熱方式,柱溫箱溫度會略微高于色譜柱實際溫度,且升溫速率越大該差值越大[13-15]。當(dāng)以20℃·min－1的升溫速率加熱時,需要將柱溫箱溫度扣減5℃得到色譜柱溫度,2-氰基溴芐的流出溫度大致為180℃,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的流出溫度約為185℃。試驗中采用快速升溫的方式升溫至180℃使得2-氰基溴芐流出,后緩慢升溫至185℃,在該溫度下恒溫一倍的色譜柱死時間以提高3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的分離度,最后快速升溫至300℃,老化色譜柱。

圖3 2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐在不同的色譜柱升溫程序下的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatogram of 2-cyanobromobenzyl,3-cyanobromobenzyl and 4-cyanobromobenzyl under different chromatographic column heating procedure

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)譜基峰均為116,根據(jù)結(jié)構(gòu)式可知碎片均來自于氰芐基。采用子離子掃描方式,選擇質(zhì)荷比(m/z)116作為初級離子,碰撞能量設(shè)置為10,15,25,35 eV,子離子掃描m/z范圍為50～150。分析質(zhì)譜子離子掃描數(shù)據(jù)顯示m/z116能得到m/z為89和63兩個碎片離子,同時未打碎的m/z116處也有較強響應(yīng)。由結(jié)果得知最佳信噪比離子對的m/z為116/89,選擇該離子對為定量離子對;m/z為116/63和m/z116/116離子對作為定性離子對。2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的最佳碰撞能量分別為15,35,10 e V,且3種化合物質(zhì)譜信息一致。

2.3 標(biāo)準曲線、檢出限和測定下限

配制質(zhì)量濃度分別為5,15,22.5,30μg·L－1的3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的混合標(biāo)準溶液系列,按照儀器工作條件進行測定,以3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準曲線。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的質(zhì)量濃度均在5.0～30.0μg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的色譜峰面積之間呈線性關(guān)系,3-氰基溴芐的線性回歸方程為y＝2.996×103x－2.693×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 8,y軸截距比100%響應(yīng)值為6.3%;4-氰基溴芐的線性回歸方程為y＝2.659×103x－3.710×103,相關(guān)系數(shù)為0.998 7,y軸截距比100%響應(yīng)值為10%。

以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),以10倍的信噪比計算方法的測定下限(10S/N)。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的檢出限均為2.0μg·L－1,測定下限均為5.0μg·L－1。

2.4 精密度試驗

平行配制6份系統(tǒng)適用性溶液,按儀器工作條件進行測定,計算3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測定值的相對標(biāo)準偏差(RSD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):3-氰基溴芐測定值的RSD為1.2%,4-氰基溴芐測定值的RSD為3.3%,說明該方法重復(fù)性良好。

由不同的分析人員在不同的日期使用不同儀器按照上述方法進行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn):12份待測溶液中3-氰基溴芐測定值的RSD為4.9%,4-氰基溴芐測定值的RSD為3.5%。表明該方法的再現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗

按照試驗方法對陰性樣品進行低、中和高等3種不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗,計算3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的回收率,結(jié)果見表2。

表1 回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of test for precision

由表2可知:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的回收率分別為92.1%～97.0%和102%～109%。

2.6 溶液的穩(wěn)定性試驗

試驗考察了待測樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液以及3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準溶液在25℃條件下放置0,2,5,9,12,18 h后的峰面積變化情況。結(jié)果表明:3-氰基溴芐和4-氰基溴芐標(biāo)準溶液、待測樣品溶液及系統(tǒng)適用性溶液在25℃條件下放置18 h后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的峰面積與放置0時相比,峰面積的相對偏差小于5%。表明各溶液在25℃條件下放置18 h后穩(wěn)定性良好。

2.7 專屬性試驗

移取1.1節(jié)處的各溶液1μL注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,記錄其色譜圖。結(jié)果表明:空白溶液不干擾3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測定,2-氰基溴芐、3-氰基溴芐和4-氰基溴芐保留時間分別為8.058,8.617,8.759 min,相鄰色譜峰的分離度分別為7.1,2.8。表明該方法專屬性良好。

2.8 耐用性試驗

試驗通過改變載氣流量為(1.1±0.1)mL·min－1、分流比為4∶1～6∶1、電子轟擊能量變化范圍為－5～＋5 e V來評估試驗條件有微小變化時,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測定結(jié)果的受影響程度。系統(tǒng)適用性試驗中,電子轟擊能量變化范圍為－5～＋5 eV,分流比分別變?yōu)?∶1及6∶1后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測定值的RSD均小于5.0%;但是流量變化±0.1 mL·min－1后,3-氰基溴芐和4-氰基溴芐測定值的RSD均大于5.0%,提示在選定的色譜條件下載氣的流量需準確設(shè)定。

2.9 樣品分析

按照試驗方法對批號分別為ALOB1710009、ALOB1810007和ALOB1902002的3批樣品進行測定。結(jié)果表明:3批樣品中均未檢出3-氰基溴芐和4-氰基溴芐。

本工作采用GC-MS/MS結(jié)合中等極性的毛細管色譜柱同時分離測定了2-氰基溴芐中2種化學(xué)性質(zhì)相似的含鹵代烷烴類基因毒性結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體極性化合物,方法操作簡便、分離度好,能快速測定2-氰基溴芐中潛在基因毒性雜質(zhì)3-氰基溴芐和4-氰基溴芐的微量殘留,可為苯甲酸阿格列汀的用藥安全提供保障。