右美托咪定對脂多糖誘導的子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB/NLRP3炎性小體介導的炎性反應的影響

李鮮風 楊麗絹

子宮內膜炎是女性常見的生殖道疾病，其特點是子宮內膜的持續性炎性反應，并引起許多生育問題，包括自發性早產和習慣性流產等[1]。脂多糖(LPS)作為革蘭陰性細菌外膜的主要成分，是誘發子宮內膜炎的關鍵因素[2]。

Toll樣受體(TLR)是一類細胞內模式識別受體(PRR)，通過識別脂多糖(LPS)、膜脂蛋白等分子參與機體的先天性和適應性免疫反應[3]。TLR4是TLR家族重要的成員之一，能夠識別外源性配體LPS[4]。LPS與TLR4結合能夠引起細胞內的信號轉導反應，如激活核因子(NF)-κB信號通路，NF-κB信號活化能夠促進細胞內相關信號分子的轉錄，包括NLRP3炎性小體相關分子及細胞因子(IL-1β、TNF-α)的表達[5]。NLRP3炎性小體是細胞內的重要胞質識別受體，主要成分包括NLRP3、caspase-1、ASC等[6]。NLRP3炎性小體活化后，其能夠誘導細胞產生大量的IL-1β和IL-18，加重炎性反應[7]。因此，抑制TLR4-NF-κB信號介導的NLRP3炎性小體活化對于炎性疾病的治療具有潛在的價值。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種有效的選擇性α-腎上腺素能受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛的效果[8]。近年來，研究表明DEX能夠通過阻斷NF-κB信號通路對脊髓損傷、心肌缺血再灌注及膿血癥等模型發揮良好的抗炎效果[9]。但是DEX對子宮內膜炎的作用和相關分子機制尚未完全清楚，因此，本研究采用LPS誘導的小鼠子宮內膜炎模型探索DEX的抗炎作用及相關分子機制。

材料與方法

1.實驗材料：脂多糖(LPS)(美國西格瑪奧德里奇公司)；HE染色液(上海碧云天生物技術有限公司)；IL-1β、IL-18、TNF-α 小鼠ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)；RT-PCR反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；caspase-1、ASC及NLRP3抗體(美國細胞信號技術公司)；TLR4、p-p65、p65、GAPDH抗體(上海艾博抗貿易有限公司)；HRP標記山羊抗兔IG(美國英杰生命技術有限公司)，右美托咪定注射劑(江蘇揚子江藥業集團有限公司)。

2.動物分組給藥及小鼠子宮內膜炎模型建立：所有動物試驗均經過動物倫理學委員會的同意和批準，將40只C57BL/6小鼠(雌性，20～22g)隨機分為對照組、模型組、右美托咪定組(10、20、40μg/kg)，每組8只，右美托咪定腹腔注射給藥，對照組和模型組給予等體積的0.9%NaCl注射液。給藥后30min，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，倒提固定，用自制小鼠子宮灌注器向小鼠子宮內注射LPS(5mg/ml，溶解于PBS溶液)20μl，對照組注射等體積PBS溶液。在LPS注射24h后，眼球取血，脫頸椎處死，解剖分離小鼠子宮組織。

3.HE病理染色：分離收集小鼠子宮組織，切取約0.5cm，置于中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成4μm薄片，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察子宮組織的病理變化，并評分。評分標準：(1)水腫：正常為0分；輕微為1分；適中為2分；嚴重為3分。(2)炎性細胞浸潤：0～1為0分；2～5為1分；6～10為2分；11～15為3分；16～20為4分；>20為5分。

4.ELISA法：采用ELISA法檢測小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α的分泌水平，小鼠眼球取血，用1.5ml EP管收集血液，4℃靜置過夜，3000r/min離心5min，吸取上清，使用ELISA試劑盒根據制造商說明檢測小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量。

5.RT-PCR檢測：分離收集小鼠子宮組織，稱取約30mg，加入1ml TRIzol(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(美國賽默飛世爾科技公司)檢測總RNA的純度和濃度，用反轉錄試劑盒將RNA(1μg)反轉錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)的CFX ConnectTMReal-Time系統(美國伯樂公司)進行qRT-PCR定量分析，擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃延伸30s，重復40個循環，最后根據2-ΔΔCt法計算IL-18、IL-1β、TNF-α、GAPDH mRNA的表達水平，RT-PCR引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列

6.蛋白印跡免疫分析(Western blot法)：分離收集小鼠子宮組織，稱取約30mg，采用Western blot法檢測子宮組織中caspase-1、ASC、NLRP3、TLR4、p-p65及p65的蛋白表達水平。根據制造商說明操作提取組織總蛋白，采用BCA法(上海碧云天生物技術有限公司)對蛋白進行定量，加入Loading buffer(4X)于100℃煮沸5min，然后進行SDS-PAGE電泳來達到分離蛋白的目的，電泳條件：80V，30min；120V，60min。隨后采用100V，90min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(美國密理博公司)，用5%脫脂奶粉封閉60min，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用一抗(caspase-1、ASC、NLRP3，按1∶1000稀釋；TLR4、p-p65、p65及GAPDH，按1∶500稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用二抗(HRP標記山羊抗兔IG，按1∶10000稀釋)孵育90min，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用ECL化學發光法(Millipore，MA)顯影檢測，Image J分析灰度值，GAPDH用作內參對照。

結 果

1.右美托咪定(DEX)對子宮內膜炎小鼠子宮組織病理變化的影響：采用HE染色檢測小鼠子宮組織的病理變化情況，與對照組小鼠比較，模型組小鼠的子宮組織中出現大量的炎性細胞浸潤，子宮肌層出現水腫，黏膜出現損傷和增生，同時炎癥評分顯著增加；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性緩解子宮內膜炎小鼠子宮組織中LPS誘導的炎性細胞浸潤和子宮肌層水腫，并緩解子宮黏膜損傷，顯著減少炎癥評分(圖1)。

圖1 右美托咪定對子宮內膜炎小鼠子宮組織病理變化的影響A～E.HE染色;A.對照組；B.模型組；C～E.右美托咪定組(10、20、40μg/kg);F.子宮內膜炎小鼠子宮組織病理炎癥評分比較。與對照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

2.右美托咪定(DEX)對子宮內膜炎小鼠血清中炎性因子分泌水平的影響：采用ELISA法檢測子宮內膜炎小鼠血清中炎性因子的分泌水平，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量均顯著增加；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性降低子宮內膜炎小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的水平(圖2)。

3.右美托咪定對子宮內膜炎小鼠子宮組織中炎性因子表達水平的影響：采用RT-PCR法檢測子宮內膜炎小鼠子宮組織中炎性因子的表達水平，與對照組比較，模型組小鼠子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA的表達水平顯著上調；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性顯著下調子宮內膜炎小鼠子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA的表達水平(圖3)。

圖2 右美托咪定對子宮內膜炎小鼠血清中炎性因子分泌水平的影響A.子宮內膜炎小鼠血清中IL-1β的水平；B.子宮內膜炎小鼠血清中IL-18的水平；C.子宮內膜炎小鼠血清中TNF-α的水平，與對照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

圖3 右美托咪定對子宮內膜炎小鼠子宮組織中炎性因子表達水平的影響A.子宮內膜炎小鼠子宮中IL-1β mRNA的表達水平；B.子宮內膜炎小鼠子宮中IL-18 mRNA的表達水平；C.子宮內膜炎小鼠子宮中TNF-α mRNA的表達水平，與對照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

4.右美托咪定(DEX)對子宮內膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體活化的影響：采用Western blot法檢測子宮內膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體相關分子的蛋白表達水平，與對照組比較，模型組小鼠子宮組織中caspase-1、ASC及NLRP3的蛋白表達顯著上調；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性下調子宮內膜炎小鼠子宮組織中caspase-1、ASC及NLRP3的蛋白表達(圖4)。

圖4 右美托咪定對子宮內膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體活化的影響與對照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

5.右美托咪定(DEX)對子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路活化的影響：采用Western blot法檢測子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路相關分子的蛋白表達水平，與對照組比較，模型組小鼠子宮組織中TLR4、p-p65/p65的蛋白表達顯著上調；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性下調子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4、p-p65/p65的蛋白表達水平(圖5)。

圖5 右美托咪定對子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路活化的影響與對照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

討 論

子宮內膜炎發生于女性的子宮內膜，是一種常見的婦科疾病，其能夠引起包括不孕、流產在內的諸多生育問題，這對患者造成了嚴重的經濟負擔[10]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細菌外膜的主要成分，是誘發子宮內膜炎的關鍵因素，近年來LPS誘導的子宮內膜炎動物模型廣泛應用于該疾病的研究[11]。右美托咪定(DEX)是一種選擇性α-腎上腺素能受體激動劑，其具有鎮痛和鎮靜的效果。本研究發現，小鼠子宮注射LPS能夠引起小鼠子宮發生肌層水腫及炎性細胞浸潤等炎性反應，腹腔注射給予小鼠DEX能夠緩解子宮內膜炎的發展，包括抑制子宮肌層水腫及炎性細胞浸潤，上述結果表明本研究成功建立了小鼠子宮內膜炎模型，并表明DEX對治療子宮內膜炎具有潛在的價值。

LPS通過激活先天性免疫反應產生強烈的促炎信號，這些促炎信號在機體的免疫系統穩態調節過程中發揮至關重要的作用[12]。但是，釋放過量的炎性因子能夠引起炎癥級聯反應，并且損害組織[13]。因此，抑制炎性因子的產生對治療炎癥疾病具有重要意義。IL-1β是一種重要的促炎細胞因子，具有廣泛的全身和局部作用，并能夠調節免疫細胞和非免疫細胞功能[14]。TNF-α是一種急性期蛋白，可啟動細胞因子級聯反應，增加血管通透性，促進巨噬細胞和中性粒細胞向感染部位募集，并參與炎癥疾病[15]。IL-18是一種前炎性細胞因子，能夠調節多種細胞因子的分泌，在免疫調節、感染性及慢性炎癥疾病過程中具有重要的作用。本研究表明DEX能夠顯著降低子宮內膜炎小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的水平，同時下調子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α的表達水平，上述結果表明DEX對子宮內膜炎的治療作用與下調子宮內膜炎小鼠的炎性因子水平有關。

成熟的IL-1β和IL-18產生和分泌與NLRP3炎性小體活化密切相關，除此之外，IL-1β和TNF-α產生和分泌也是基于NF-κB信號通路活化的[16]。NLRP3炎性小體激活后，ASC和NLRP3結合誘導caspase-1聚集，自激活和促進IL-1β和IL-18成熟[17]。本研究表明DEX能夠抑制子宮內膜炎小鼠子宮組織中ASC、NLRP3和caspase-1的表達水平，上述表明DEX的抗炎作用與抑制NLRP3炎性小體活化有關。

TLR4是TLR家族的成員，其作為LPS的受體介導細胞免疫應答，最終導致NF-κB信號通路的活化，NF-κB信號轉導通路對于調節NLRP3炎性小體活化具有重要作用[18]。因此本研究假設DEX的抗炎作用與抑制TLR4介導的NF-κB信號通路活化有關。本研究結果表明DEX能顯著下調子宮內膜炎小鼠子宮組織中TLR4的表達水平。在正常情況下，p65與IκBα結合存在于細胞質中，當LPS刺激時，IκBα將會磷酸化并降解，p65磷酸化并進入細胞核，促進核基因的轉錄，包括NLRP3炎性小體相關成分、IL-1β、IL-18、TNF-α，從而加重炎性反應[19]。本研究表明DEX能夠通過下調p-p65/p65的表達抑制NF-κB信號通路的活化，上述結果表明DEX的抗炎作用可能與TLR4介導的NF-κB信號通路相關分子的表達下調有關。

綜上所述，本研究表明右美托咪定(DEX)腹腔注射給予子宮內膜炎小鼠，能夠緩解小鼠子宮內膜炎，并且與抑制子宮組織中TLR4-NF-κB/NLRP3炎性小體介導的炎性反應有關，因此右美托咪定對于治療子宮內膜炎具有潛在的價值。