金雀異黃素通過ROS-NLRP3-IL-1β途徑保護角膜上皮細胞免受高滲刺激誘導的損傷

周 洋 陳婷妍 美麗巴努·玉素甫

干眼(dry eye, DE)是常見的眼科疾病之一，指淚液的量、質或流體動力學異常引起的淚膜不穩定和(或)眼表損害，進而導致眼不適癥狀及視功能障礙[1]。干眼的發病機制復雜，炎癥、細胞凋亡、性激素水平等因素均被報道參與了干眼病理過程。然而，干眼病理過程的最終通路是淚膜不穩定，淚液中電解質濃度升高導致淚液滲透壓升高。因此，淚液的高滲透壓引起的眼表炎癥是該疾病的標志[2,3]。響應高滲應激(HS)產生的活性氧(ROS)不僅會引發眼表氧化應激，還會引發涉及核因子κB(NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的炎癥級聯反應途徑產生各種促炎細胞因子和趨化因子[4]。

炎性小體(inflammasome)是由多種蛋白質組成的復合體，能夠調節caspase-1的活化進而在天然免疫防御的過程中促進細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟[5]。其還能調節caspase-1依賴的形式編程性細胞死亡，誘導細胞在炎性和應激的病理條件下死亡。其中，NLRP3炎性小體可以促進了IL-1β的成熟[6]。越來越多的證據表明，NLRP3參與了DE的發病機制。例如，在DE患者的眼表檢測到了NLRP3炎性小體[7]。在大鼠 DE模型中，HS誘導產生的ROS可以激活NLRP3炎性小體[8]。此外，也有研究表明，ROS誘導的NLRP3激活通過caspase-1導致IL-1β分泌的增加，突出了ROS-NLRP3-IL-1β信號通路在DE進程中的啟動作用[9,10]。因此，研究此重要步驟可能有益于控制DE中眼表炎癥的發生。

金雀異黃素(genistein，Gen)是一種存在于豆類作物和齒狀植物中的天然異黃酮，是有益于健康的化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒感染、抑制腫瘤細胞增殖等作用[11～13]。金雀異黃素對免疫系統的影響也有廣泛的研究。然而，尚未有研究金雀異黃素對DE中NLRP3炎性小體活化的影響。因此，本研究旨在研究金雀異黃素在HS誘導的NLRP3炎性小體激活中的作用及其潛在機制。

材料與方法

1.試劑與材料：金雀異黃素(genistein)、胰蛋白酶、DMEM 培養基、氯化鈉、CM-H2DCFDA試劑盒、ELISA 試劑盒購自美國Sigma 公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 購自瑞士Roche公司，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶測定試劑盒購自碧云天生物技術公司，兔抗人NRF2抗體、兔抗人Lamin B、山羊抗兔 IgG抗體購自美國Millipore公司，TIRzol試劑盒、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ 試劑盒購自日本TaKaRa公司。人永生化角膜上皮細胞(iHCEC)和原代角膜上皮細胞(priHCEC)購自美國標準生物品收藏中心。

2.細胞培養與分組處理：iHCEC和priHCEC用包含10%胎牛血清、100U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，在 37℃、5%CO2培養箱中進行培養。當細胞生長至融合度達 80%～90%時，用 0.25% 胰蛋白酶消化5min。在DMEM 培養基中加入無菌飽和氯化鈉溶液，分別調整培養基滲透壓為 312mOsm/L(正常滲透壓)和350、400、450mOsm/L(高滲透壓)。將細胞隨機分成3組進行對應處理：①對照組(312mOsm/L正常滲透壓培養基培養細胞)；②高滲刺激組(分別使用350、400、450mOsm/L高滲透壓培養基培養細胞)；③金雀異黃素組(細胞先在50μmol/L金雀異黃素中預處理30min，再在450mOsm/L高滲透壓培養基中培養)。

3.CCK-8檢測：將iHCEC和priHCEC重懸，以1×104個/孔均勻鋪于 96 孔板中，在37℃、5%CO2培養箱中培養 24h。按分組給予不同處理繼續培養24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，在酶標儀上450nm 處檢測各組吸光光度值。

4.細胞轉染 siRNA：將iHCEC以2×105個/孔接種至 24 孔板中進行相應處理后，加入100μl Opti-MEM， 5μl X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，混合均勻，加入1μg的NRF2 siRNA(陰性對照組加nc siRNA)，短暫渦旋后室溫孵育 20min。細胞在37℃、5%CO2培養箱中孵育24h后，丟棄上清，PBS洗滌3次，換用10%胎牛血清的 RPMI1640 培養液繼續培養進行后續操作。

5.ROS測定：將iHCEC以2×104個/孔的密度接種在96孔板中，按分組給予不同處理后培養24h。加入10μmol/L CM-H2DCFDA在37℃下孵育30min后，用PBS洗滌兩次，使用熒光顯微鏡進行觀察拍照，并在酶標儀450nm 處檢測各組吸光光度值。

6.酶活性測定：將2×104個/孔的密度接種于96孔板中的各組iHCEC進行相應處理后，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，離心棄上清，加入 RIPA 裂解液抽提各處理下的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，之后按照試劑盒說明測定細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(Catalase)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性。

7.免疫熒光染色：按不同處理iHCEC 24h 后，用4% PFA固定15min后，將細胞在室溫下用0.3% Triton X-100透化15min，加入免疫熒光封閉液，室溫封閉 30min，分別加入一抗8-OHdG (1∶100)4℃孵育過夜，次日PBS 漂洗 3 次，將細胞與Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)暗室室溫孵育1h，DAPI染色10min，PBS漂洗 3 次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

8.ELISA檢測：收集不同處理后iHCEC和priHCEC細胞培養上清液加入96孔板，濕盒中4℃過夜；使用PBST洗板3次，加入2%小牛血清室溫封閉1h，每孔加入兔抗人IL-1β抗體(1∶100)，37℃孵育1h，洗板3次，各孔加入HRP標記山羊抗兔IgG抗體(1∶5000)室溫孵育1h后終止反應，洗板3次，四甲基聯苯胺過氧化物酶溶液顯色，于酶標儀450nm 處測各孔的吸光度值。

9.Western blot法：使用 RIPA 裂解液抽提各處理后iHCEC細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE膠，進行凝膠電泳分離蛋白，切膠并轉移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2h。分別加兔抗NRF2 (1∶1000)、兔抗Lamin B (1∶2000) 抗體，4℃孵育過夜；HRP標記的山羊抗兔 IgG抗體(1∶5000)，室溫孵育 2h；采用 ECL發光顯影，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質灰度值。

10.RT-PCR 檢測：使用TIRzol試劑盒提取各處理下iHCEC細胞總 RNA，用 Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒獲取第1鏈 cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ 試劑盒檢測基因表達，以GAPDH 作為內參基因。擴增體系：上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA 2μl、SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5μl、無酶水8.5μl。擴增條件：95℃ 3min，95℃ 30s，58℃ 30s，58℃ 30s，40個循環。表達水平均使用2-ΔΔCt法來計算。由上海吉瑪公司設計并合成各個基因的引物，具體序列詳見表1。

表1 各基因qPCR引物序列

結 果

1.金雀異黃素對HS誘導的iHCEC和priHCEC細胞的保護作用：結合相關研究，本試驗選擇50μmol/L金雀異黃素進行預處理。將iHCEC和priHCEC在不同滲透壓培養基中培養24h后，與對照組比較，在HS 450mOsm/L時iHCEC和priHCEC活力降低到58.5%、50.7%(P<0.05)；而與HS 450mOsm/L比較，細胞在50μmol/L金雀異黃素預處理后再在HS 450mOsm/L培養基中培養，iHCEC和priHCEC的活性顯著提高(P<0.05)，細胞活性分別達到89.3%和78.9%。

圖1 CCK-8檢測不同處理后iHCEC和priHCEC細胞活性A.不同處理下iHCEC活性；B.不同處理下priHCEC活性；與對照組比較，*P<0.05；與450mOsm/L組比較，#P<0.05

2.金雀異黃素抑制HS誘導的NLRP3活化：與對照組比較，在HS 450mOsm/L下iHCEC和priHCEC細胞中IL-1β的分泌水平均顯著增加(P<0.01)，而用50μmol/L金雀異黃素預處理細胞，IL-1β的分泌水平均顯著降低(P<0.01,圖2)。使用450mOsm/L的高滲培養基刺激iHCEC后，RT-PCR結果表明，在HS誘導下NLRP3、CASP1、IL-1β和IL-18mRNA的表達水平較高，而50μmol/L金雀異黃素預處理細胞后再于HS 450mOsm/L培養，這些基因的表達水平均顯著下降(圖3，P<0.05)。

圖2 ELISA檢測不同處理后iHCEC和priHCEC細胞中IL-1β的分泌水平A.不同處理下iHCEC中IL-1β的分泌水平；B.不同處理下priHCEC中IL-1β的分泌水平；與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖3 RT-PCR檢測不同處理iHCEC中NLRP3、CASP1、IL-1B和IL-18 mRNA的表達水平*P<0.05

3.金雀異黃素通過激活NRF2抗氧化劑信號轉導來抑制HS誘導的氧化應激：ROS測定結果顯示，與對照組比較，在450mOsm/L HS 培養iHCEC細胞24h后，細胞內ROS水平增加了約3倍(P<0.01)，而用50μmol/L金雀異黃素預處理可以阻止ROS的升高(圖4，P<0.01)。與對照組比較，在450mOsm/L HS 下，iHCEC細胞中的另一種氧化應激的生物學標志物8-OHdG升高了約6倍(P<0.01)，而50μmol/L金雀異黃素預處理同樣顯著地抑制了8-OHdG的增加(圖5，P<0.01)。與對照組比較， 450mOsm/L HS 下iHCEC細胞核中NRF2蛋白水平顯著增加，而與450mOsm/L HS比較，50μmol/L金雀異黃素預處理再于HS 450mOsm/L培養，NRF2蛋白水平也顯著增加(P<0.05，圖6)。檢測轉染siRNA后iHCEC細胞，與nc siRNA比較，在轉染NRF2 siRNA的細胞中NRF2 mRNA的表達水平顯著下降(P<0.01,圖7)。而金雀異黃素對IL-1β產生的抑制作用基本上被NRF2沉默所解除(P<0.05)。通過有關酶活性檢測發現， NRF2誘導其調節的抗氧化酶的表達。與對照組比較，450mOsm/L HS 下iHCEC細胞中SOD、Catalase和GR的活性顯著下降(P<0.01)，而50μmol/L金雀異黃素預處理顯著提高了其活性(圖8，P<0.01)。

圖4 CM-H2DCFDA探針檢測不同處理下iHCEC細胞內ROS生成與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖5 免疫熒光染色檢測不同處理下iHCEC細胞中8-OHdG與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

圖6 Western blot法檢測不同處理下 iHCEC細胞中NRF2蛋白的表達水平與對照組比較，*P<0.05；與450mOsm/L組比較，#P<0.05

圖7 不同處理iHCEC細胞轉染 siRNA后NRF2 mRNA的表達水平與IL-1β分泌水平測定A.RT-PCR檢測轉染后iHCEC細胞中NRF2 mRNA的表達水平，與nc siRNA比較，*P<0.01;B.ELISA檢測iHCEC細胞中IL-1β的分泌水平，*P<0.05

圖8 不同處理iHCEC細胞中酶活性的檢測A.SOD檢測試劑盒檢測細胞中SOD含量；B.Catalase檢測試劑盒檢測細胞中Catalase含量；C.GR檢測試劑盒檢測細胞中GR含量；與對照組比較，*P<0.01；與450mOsm/L組比較，#P<0.01

討 論

角膜上皮屏障功能的重要結構基礎是緊密連接存在于頂層角膜上皮細胞之間，而干眼會引起角膜上皮細胞脫落[14]。治療干眼病的基本目標是改善角膜上皮細胞的病理狀態，但引起這一病理改變的具體因素并不清楚。本研究通過實驗研究發現，高滲環境會導致人角膜上皮細胞活性降低，而金雀異黃素可以抑制HS誘導的人角膜上皮細胞活性下降，證明了金雀異黃素可以保護細胞免受HS誘導的損傷。

非感染性炎癥是干眼發病的重要因素。近年來關于淚腺、淚液以及結膜內炎性細胞和炎性介質等免疫因素的研究發現，多種類型干眼的淚腺組織、結膜組織以及淚液中T細胞增高，MHC-Ⅱ和 HLA-DR 陽性細胞增高，炎性因子 IL-1、TNF-α、MMP-9 等含量增高，均提示炎性因子在干眼發病中起重要作用[15]。炎性因子在角膜上皮細胞中高表達，參與免疫細胞向角結膜的聚集，導致了炎癥的不斷循環[16]。已有研究證明，在干眼相關的炎癥中ROS-NLRP3-IL-1β信號通路具有引發作用。HS誘導的氧化應激，特別是ROS的產生，已被認為是引發NLRP3炎性體激活的關鍵觸發因素，高滲刺激下可在15min內迅速誘導HCEC產生ROS，隨后激活NLRP3導致pro-IL-1β mRNA和蛋白表達增加[8]。在本研究中，金雀異黃素預處理可以阻止了HS誘導的iHCEC和priHCEC細胞IL-1β分泌水平的增加，降低炎性體相關基因NLRP3、CASP1、IL1B和IL-18 mRNA的表達水平。在450mOsm/L HS 下iHCEC細胞內ROS水平顯著增加，而用金雀異黃素預處理可以阻止ROS的升高。同樣，金雀異黃素預處理下顯著地抑制了iHCEC細胞中的另一種氧化應激的生物學標志物8-OHdG的增加。

NFR2 是內源性抗氧化防御系統的關鍵調節蛋白，可以抵抗氧化應激的主要細胞的防御機制，保護其免受炎癥引起的氧化損傷。在氧化應激條件下NFR2發生核轉位，與抗氧反應元件結合，啟動抗氧化酶基因的轉錄從而發揮抗氧化的保護作用[17]。本研究表明，iHCEC細胞中NRF2蛋白水平在金雀異黃素預處理下較450mOsm/L HS 下仍增加，而通過轉染NRF2 siRNA發現，金雀異黃素對IL-1β分泌產生的抑制作用基本上被NRF2沉默所解除，由此說明金雀異黃素的作用可能是通過激活NFR2來實現的。若 Nrf2 缺失或存在激活障礙，則會進一步加重細胞的氧化性損傷和炎性損傷，導致細胞生理功能障礙，最后甚至導致細胞凋亡或壞死，還可導致與氧化應激和炎癥相關的疾病的發生[18]。本研究中iHCEC細胞在450mOsm/L HS刺激后，金雀異黃素顯著促進了細胞核中NRF2表達，而同時NRF2誘導了幾種抗氧化酶(SOD、Catalase和GR)的表達，且在金雀異黃素作用下這幾種抗氧化酶的活性均升高。由此證明了金雀異黃素可以通過激活NRF2抗氧化劑來消除HS誘導的氧化應激。

綜上所述，本研究表明，金雀異黃素可以保護HS誘導的人角膜上皮細胞的損傷，這種保護作用是通過激活NRF2抗氧化劑來抑制ROS-NLRP3-IL-1β信號通路實現的，并且誘導NRF2轉運至細胞核，增強了幾種抗氧化酶的活性。金雀異黃素可能會抑制HS誘導的細胞炎癥的啟動階段，并具有在較早階段預防和減輕與干眼相關的角膜炎癥的潛在能力。