超聲靶向微泡破壞在腫瘤基因治療中的應用現狀及研究進展

張 波 王琳萍

2000年人類基因組測序完成標志著分子醫學的新時期，新時期的醫學發展趨勢主要為基因檢測和分子治療。基因治療領域的科學家在改善基因導入協同和載體方面付諸了大量的努力，新思路、新技術和新方法層出不窮。目前，關于基因導入載體有兩大主流：一是非病毒載體系統，劣勢為安全性差；二是病毒載體系統，劣勢為轉染低效性。納米醫學技術的產生和發展為提高非病毒性載體的轉染率帶來了曙光。非病毒載體和人工載體的深入研究將成為基因治療的重要策略。

一、基因治療及超聲靶向微泡破壞技術概述

1.基因治療：基因治療是將外源性基因導入病變組織，從功能上取代有缺陷的基因或產生相應的生物學效應。目前已成功應用于多種遺傳病以及獲得性疾病的臨床前研究試驗，包括腫瘤、神經退行性疾病和心血管疾病[1]。

2.納米級超聲造影劑：隨著對細胞和組織特異性分子標記理解的進步，功能化微泡也得到了發展，目前用于靶向分子成像的研究。當微泡暴露在超聲波下時，它們會發生體積振蕩，并再次輻射出二次聲響應，其振幅明顯高于同等大小的剛性球體產生的散射。因此，它們比紅細胞產生更強的回聲，使它們能夠作為血池(blood pool)試劑使用。此外，即使在中等超聲壓力下，微泡振蕩也可能是高度非線性的，由此產生的輻射信號中的諧波含量可用于實現更高的組織對比度[2]。

超聲造影劑已由游離微泡(用于右心系統顯像)、包裹空氣的微泡、包裹氟碳類氣體的微泡發展到了包裹惰性氣體的靶向性超聲造影劑(targeted ultrasound contrast agents，tUCAs)，tUCAs可分為微米級tUCAs和納米級tUCAs(一般為450～700nm)，通常認為直徑<700nm的超聲造影劑可以通過腫瘤組織的高通透性及滯留效應(即EPR效應)實現血管外成像。

目前，納米級超聲造影劑根據成膜材料主要分為以下3類:(1)高分子聚合物類：以多于 4個碳原子為全氟烷液體形式作為內核，且以聚合物和天然大分子為主，包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚 L-乳酸(PLLA)、聚己內酯(PCL) 等，其優點是易于制備、粒徑均一、穿透力和穩定力強，適用于延遲成像和聚集顯像，通過修飾和改性可實現藥物緩釋，是目前報道最多的一種納米級超聲造影劑。但需要較強的超聲能量才能使其發生有效的振動，這可能引發細胞溶解、毛細血管破裂等不良生物反應。(2)脂質類：納米脂泡造影劑為內含惰性氣體成分(包括氟碳氣體或者氟硫氣體)，外為脂質成分構成的聲學造影劑，在超聲激勵下增強效率較低，但氣體包裹率高，多用于攜帶靶向藥物治療和基因轉染；納米級脂質造影劑是在制備脂質體的基礎上進行改造，使其內部含有許多小的氣體囊泡，常用的包括飽和與不飽和的磷脂酸、磷脂酰膽堿、乙醇胺和膽固醇等，以及包括一些化學成分(如生物素、熒光和聚乙二醇等)修飾后的對應物質。超聲顯像效果介于上述兩種納米級超聲造影劑之間，適用于遞送藥物和多模態顯像，安全無毒，可用于臨床。(3)無機納米材料類：二氧化硅及納米金等，具有良好的組織相容性、生物穩定性及較高的反應活性，可用于多模態成像，實現對腫瘤的診療一體化。

3.超聲靶向微泡破壞技術：超聲與微泡不僅能夠進行聲學成像，還可以實現基因與藥物的靶向遞送。在活體內，將靶向微泡偶聯或包載基因/藥物，在特定部位發射不同聲強的超聲波，達到基因/藥物的定點釋放，當超聲強度足夠大時血液中的微泡發生破裂，通過產生微射流、沖擊波使周圍的血管壁或細胞膜表面出現可逆的或不可逆的穿孔，使血管內皮屏障損傷，進而增加血管通透性，增加外源性物質到達特定部位的劑量，從而發揮相應的生物學效應。UTMD的可能機制包括空化效應及其二級效應、內吞作用與聲輻射力及活性氧促Ca2+內流等方面[3]。UTMD所產生的空化效應和致死性聲孔效應可直接導致腫瘤細胞發生裂解死亡，這為UTMD直接治療腫瘤提供了理論依據。

4.基因傳遞系統：基因轉染技術系統包括病毒傳遞系統和非病毒傳遞系統。以病毒為載體時基因轉染率雖高但安全性差，且易引起機體產生免疫反應。Carlo等[4]開發了一種基因轉移方法，該方法結合了脂質包裹的全氟化碳微泡和超聲波來保護人類腺病毒并將其傳遞至目標組織。以質粒、脂質體等非病毒為載體的基因轉染，雖具有生物安全性和成本效率優勢，但轉染率低、靶向性差，存在適用范圍受限和有創等缺點。Zhang等[5]開發了一種新型殼聚糖結合的脂質微泡，它具有良好的生物相容性和較高的基因負載能力，結合UTMD可促進安全高效的基因體外轉染和體內靶向基因傳遞的潛力。

二、UTMD在腫瘤基因治療中的應用

靶向微泡作為載體與UTMD聯合，不僅保留了UTMD非侵入性、可重復性、時空靶點特異性、低免疫原性和毒性的優點，還可進一步增強傳遞的靶向性并改善UTMD難以控釋的不足。1998 年，Price等首次報道了UTMD與納米粒在活體動物模型上的聯合應用。2008年，Lentacker等首次報道UTMD成功介導載基因納米粒的轉染，該研究表明聚乙二醇化納米粒可保護核酸免受核酸酶的影響，從而實現超聲靶向基因或siRNA的遞送。

從本質上來講，腫瘤是一種基因病，其發生、發展與復發均與基因的變異、缺失、畸形相關。隨著人類基因組計劃的順利實施和完成，以及新的人類疾病基因的發現和克隆，腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領域并初步取得令人振奮的成果，針對腫瘤的特異性分子靶點設計腫瘤治療方案，是腫瘤靶向治療中最有前景的方案。

UTMD在腫瘤組織中的應用較為成熟，在導致人類死亡的重要疾病實體腫瘤中，新生成的腫瘤微血管的內皮細胞之間存在間隙，管壁的最大孔徑為380～780nm，因此，部分粒徑較小的納米超聲造影劑穿透腫瘤血管壁，實現腫瘤細胞的靶向顯像和治療。在微泡表面裝配上對腫瘤新生血管內皮具有特異識別能力的分子探針，構建成腫瘤的特異性載基因/藥超聲靶向微泡，可高效地靶向結合于腫瘤血管內皮，對腫瘤進行早期診斷，結合UTMD技術可提高腫瘤治療的特異性和靶向性。

微泡作為超聲造影劑的發展為超聲在臨床中的應用開辟了新道路，同時也提供了眾多探索新興領域的研究機會。一些實驗開發的應用已經應用于臨床實踐，歐洲聯盟已經發布了關于它們的使用指南，特別是在肝臟中。近年來， UTMD聯合載基因納米粒已在多種腫瘤的細胞與動物實驗中獲得了良好的治療效果，包括肝癌、胰腺癌、結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質瘤、鱗狀細胞癌等(表1)。UTMD聯合納米粒在心血管疾病、視網膜疾病、中樞神經系統疾病的治療領域也展現出了一定的潛力[6～10]。

三、展 望

超聲靶向微泡破壞技術在腫瘤治療中已成為一種新型的基因/藥物傳遞方法，且取得了許多積極的治療效果。然而目前研究多停留于細胞和動物實驗階段，缺乏應用于大型動物模型的相關報道，在向臨床轉化的道路上尚有許多問題有待解決，如腫瘤的發生、發展過程、UTMD介導物質傳遞、超聲對納米粒的作用以及納米粒如何解離的機制尚未明確；優化參數的過程較為復雜；超聲微泡的應用存在安全問題，除微泡在血液循環中可能引起微栓塞和毒性外，空化效應的潛在危險性也不容忽視，以上問題均限制了臨床前實驗的推廣性，故當前的研究主要關注提高基因轉染效率及改善靶向性、生物相容性、提升負載量、多模態成像等方面。有研究者制備了經PEI-600修飾并涂有iRGD肽和抗CCR-2抗體的雙靶向陽離子微泡(MBiRGD/CCR-2)，該微泡具有良好的穩定性、包載率及靶向性，具有促進基因轉染的潛在價值。近年來出現了大量關于磁性微泡發展的研究，Chertok等[27]將肝素化的磁性納米顆粒偶聯到蛋白功能化的微泡表面，制備了具有強磁性和聲學活性的循環穩定磁性微泡(MagMB)，MagMB在循環系統中可以避開肺的截留，并且磁靶向可使其積聚在腫瘤血管內，通過超聲監測并在需要時通過超聲進行破壞。在此基礎上，通過對磁聲信號的實時監測，可以調整磁聲靶向藥物以增強其靶向性。Li等[28]構建了MBs@CS/PB/DNA的多功能基因傳遞體系，通過光熱療法與UTMD協同增效基因轉染。結果表明，MBs@CS/PB/DNA在體內外均能顯著增強超聲成像效果，表現出優異的生物相容性，使其有望進一步探索成為超聲成像、光熱治療、藥物遞送、基因治療的聯合平臺。Liu等[29]成功制造了多功能葉酸靶向和載氧/吲哚菁綠脂質納米顆粒(FA-OINPs)，用于卵巢癌細胞和皮下異種移植模型的雙模式成像引導治療，FA-OINPs被證明是極具潛力的超聲和光聲(US/PA)成像造影劑，可增強US/PA的體內外成像能力。結果提示在US/PA雙模成像的指導下，光動力/光熱介導的FA-OINPs為卵巢癌的協同治療提供了一種有前途的策略。

表1 UTMD在腫瘤基因治療中的應用

綜上所述，高效表達載體和適用于臨床的基因轉移方法是決定基因治療成功的基礎。優勢互補的多模態成像與診療一體化在綜合評價腫瘤診療方面能夠發揮巨大作用，是超聲靶向微泡破壞技術運用于腫瘤基因診療中的必然發展趨勢。隨著超聲靶向微泡破壞技術和基因治療技術的深入研究，相關作用機制將會逐漸明確，可以預期UTMD聯合基因治療腫瘤技術最后的成功，將使其更好地服務于臨床，對醫學界產生深遠的影響。