過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3表達及與Th17/Treg失衡的關系

鐘潔，陶寧，趙利，何誠，胡建平

過敏性哮喘是一種慢性炎性氣道疾病，由多種炎性細胞介導發生，全世界大約有3.5億過敏性哮喘患者，每年增加速率大約為3%，發病率逐年上升[1]。過敏性哮喘發病機制尚不明確，近年研究發現[2]，輔助性Th17細胞及調節性T細胞(Treg)在哮喘發病中占有重要地位。細胞因子信號傳導抑制蛋白(SOCS)家族是一類反饋性阻斷細胞因子信號轉導過程的調節因子，由細胞因子誘導產生，SOCS-1、SOCS-3是SOCS家族中重要的2種分子[3-4]。T細胞亞群在免疫應答和調節中發揮重要作用。研究發現[5-6]，SOCS-1、SOCS-3可通過調節T細胞亞群分化影響不同類型的免疫應答。研究表明[7]，SOCS-1、SOCS-3可被多種炎性因子和抗炎因子誘導表達，在免疫應答和免疫調節中起到重要作用。研究顯示，Th17參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病的發生發展，如系統性紅斑狼瘡、自身免疫性關節炎等[8]。體內炎性因子的異常波動可能會引起Th17/Treg比例失衡，臨床上對于Th17/Treg失衡在過敏性哮喘發生發展中的意義鮮有研究報道。現檢測過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平，并分析其與Th17/Treg失衡的關系及意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4月—2019年9月四川省遂寧市中心醫院急診科診治過敏性哮喘患者60例為哮喘組，男 31例，女29例，年齡22～54(38.15±8.23)歲；病程1～10(2.05±1.02)年；哮喘程度，輕度32例，中重度28例；患者無家族遺傳史，無其他慢性病史。選取同期醫院進行體檢的健康體檢者60例作為健康對照組，男30例，女30例，年齡24～56(39.01±8.57)歲，均經皮膚過敏原點刺試驗為陰性，且無過敏性疾病及其他慢性疾病史，無長期用藥史，近1周內無急性感染情況。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①符合過敏性哮喘診斷標準者，哮喘診斷標準參照全球哮喘防治創議(global initiative for asthma，GINA)和中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的“支氣管哮喘防治指南(2016年版)”[9]；②皮膚點刺試驗結果粉塵螨、戶塵螨陽性者，血清特異性IgE檢測結果為陽性(血清總IgE>200 U/ml)；③無其他心血管系統疾病、自身免疫系統疾病等基礎疾病；④取血4周內未使用過糖皮質激素、肝素、免疫抑制劑或其他影響試驗結果的藥物；⑤1周內無急性感染，無過敏性疾病、其他慢性病史。(2)排除標準：①非過敏性哮喘患者；②皮膚過敏原點刺試驗或血清過敏原特異性抗體均為陰性者；③患有免疫系統疾病者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 樣品制備：無菌條件下抽取2組受試者空腹狀態下外周靜脈血5 ml， 其中3 ml加入無菌肝素(20 IU/ml)抗凝管，使用密度梯度離心法對外周血單個核細胞進行分離；2 ml直接離心取血清，用于 ELISA檢測。

1.3.2 Th17細胞、Treg細胞百分率檢測：在測試管、對照管中加入外周血單個核細胞，RPMI-1640稀釋后，加入PMA和BFA二氧化碳培養箱中孵育，使用抗人CD4-FITC、IL-17A PE孵育檢測Th17細胞百分率的樣品， CD25-PE孵育檢測Treg細胞百分率的樣品；對照管使用MouseIgG1-PE孵育進行對照。使用PBS緩沖液反復洗滌后放入流式細胞儀進行檢測[Attune NxT款流式細胞儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，CD4+T細胞設門，分析門中CD4+IL-17+T細胞(Th17細胞)百分率、CD4+CD25+陽性T細胞百分率。

1.3.3 SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平檢測： 采用RNA提取試劑盒(購自北京天根生化有限公司)提取血清總RNA，反轉錄得cDNA。采用定量PCR儀(CFX96型qRT-PCR儀，購自美國Bio-Rad公司)對SOCS-1、SOCS-3 mRNA進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μl，miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應條件：95℃ 90 s，95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，45個循環，AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒購自南京vazyme生物公司。SOCS-1、SOCS-3 mRNA及內參GAPDH的引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。采用2-△△CT法對血清SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清炎性因子水平檢測： 采用酶聯免疫法測定(ELX800型全自動酶標儀，購自美國Bio-Tek公司)血清白介素-6(IL-6)、IL-17、IL-23、人轉化生長因子β1(TGF-β1)、干擾素(IFN-γ)水平，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。IL-6 ELISA試劑盒購自Sinobiological公司；IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；IFN-γ試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；為控制檢測質量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同臺儀器上操作，每個樣本均設3次重復。

1.3.5 肺功能檢測: 選擇肺功能檢測儀對所有受試者進行肺功能檢測，檢測指標包括最大呼吸第1 s呼出氣量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第1 s用力呼吸容積比值(FEV1%)FEV1/FVC。

2 結 果

2.1 2組外周血Th17細胞、Treg細胞百分率及Th17/Treg比值比較 哮喘組外周血Th17細胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組(P<0.01)，Treg細胞百分率顯著低于健康對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組外周血Th17細胞、Treg細胞百分率及Th17/Treg比較

2.2 2組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平比較 哮喘組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平高于健康對照組 (P<0.01)，見表3。

表3 2組外周血單個核細胞SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平比較

2.3 2組血清炎性因子水平比較 與健康對照組比較，哮喘組血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達水平顯著升高(P<0.01)，IFN-γ表達水平顯著降低(P<0.01)，見表4。

表4 2組炎性因子水平比較

2.4 2組肺功能比較 哮喘組患者FEV1、FVC、FEV1%均顯著低于健康對照組(P<0.01)，見表5。

表5 2組肺功能比較

2.5 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg、炎性因子水平相關性分析 過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關(r=0.488、0.606，P<0.05)，見圖1、圖2； SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平均與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1水平呈正相關(P<0.01)，與IFN-γ水平呈負相關(P<0.01)；SOCS-3 mRNA水平與SOCS-1 mRNA水平呈正相關(r=0.471，P<0.01)，見表6。

圖1 SOCS-1 mRNA與Th17/Treg比值相關性分析

圖2 SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值相關性分析

表6 SOCS-1、SOCS-3 mRNA與炎性細胞因子水平相關性分析

3 討 論

本研究發現，過敏性哮喘患者外周血單個核細胞中SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平相對于健康對照組顯著上調，提示SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘發病有關，其中SOCS蛋白是天然免疫和獲得性免疫系統中關鍵的生理性調節因子，參與調節T細胞的發育和分化、抑制細胞因子信號通路等，在免疫性疾病、感染性疾病發生中發揮重要作用[10-13]。有學者研究認為[14]，SOCS-1通過SH2結構域與細胞因子受體胞內段Janus激酶(JAK)結合，使之泛素化后降解，從而阻滯INF-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12等多種細胞因子的信號經STAT途徑傳導。SOCS-1缺陷小鼠表現出T細胞大量激活的劇烈炎性反應[15]。因此，SOCS-1被認為是防止自身免疫的重要調節分子。夏家露等[16]研究發現，SOCS-3 mRNA表達水平下調的小鼠體內IL-4水平減少，提示IL-4水平受SOCS-3 mRNA表達水平調節，二者與過敏性哮喘發生有關。說明SOCS-1、SOCS-3可能與過敏性哮喘的發病有關，推測其主要是通過調節T細胞的分化及抑制細胞因子信號通路而發揮作用。

長期以來的觀點認為，Th1/Th2失衡在過敏性哮喘中有重要作用，近年來發現Th17/Treg失衡在過敏性哮喘中作用同樣突出[17]。Treg不同于Th1/Th2，它可以表現出免疫抑制功能。初始CD4+T細胞在IL-12和IFN-γ誘導下分化為Th1細胞，參與細胞介導免疫應答；在TGF-β單獨誘導下分化為Treg細胞，分泌TGF-β，參與免疫調節；在TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17，分泌IL-6和IL-17，參與炎性反應和自身免疫性疾病[18]，IL-6可促進活化的CD4+細胞向Th17分化，形成正反饋。本研究發現，哮喘組血清中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1表達水平顯著升高，IFN-γ表達水平顯著降低，哮喘組Th17細胞百分率、Th17/Treg比值顯著高于健康對照組，Treg細胞百分率顯著低于健康對照組，提示Th17、Treg細胞百分率的變化和比例與過敏性哮喘有關。而有關研究發現[19-20]，IL-6能促進急性期蛋白合成，介導前列腺素合成，從而參與哮喘的炎性反應。IL-17是一種促炎性細胞因子，可作用于氣道上皮細胞等炎性細胞，通過刺激趨化因子、細胞炎性因子等促進嗜中性粒細胞、巨噬細胞募集引發炎性反應[21]。李小明[22]研究發現，哮喘患者支氣管活檢標本IL-17水平較健康者高，且與疾病嚴重程度有關，提示IL-17參與哮喘的發生發展。洪菲萍等[23]研究發現，經過治療后支氣管哮喘急性發作患兒病情顯著好轉，血清中IFN-γ水平顯著升高，IFN-γ有助于支氣管哮喘的診斷及病情變化的判斷。Yan等[24]研究發現，過敏性哮喘患者外周血IL-17水平較健康對照組表達增加，說明IL-17可能在哮喘初期或疾病進展期間發揮作用，但其作用尚未確定。Guerra等[25]研究發現，IL-23在過敏性哮喘等免疫類疾病中發揮重要作用。Chu等[26]研究發現，TGF-β1在哮喘組血清中水平高于健康對照組，可能與難治性哮喘發生有關。本研究與以往研究結果相似，提示過敏性哮喘患者存在不同程度炎性反應，可能與Th17/Treg失衡有關。

進一步研究發現，過敏性哮喘患者外周血SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達水平與IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β1呈正相關，與IFN-γ水平呈負相關；SOCS-1、SOCS-3 mRNA與Th17/Treg比值呈正相關，提示SOCS-1、SOCS-3 mRNA可能通過對細胞因子的調控影響Th17、Treg的細胞數量從而影響Th17/Treg比值。

綜上所述，過敏性哮喘患者外周血中存在SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達，以Th17細胞比率上升為主的Th17/Treg失衡，且過敏性哮喘患者SOCS-1、SOCS-3 mRNA高表達與Th17/Treg失衡有關。但本研究樣本量不充分，需要擴大樣本量對SOCS-1、 SOCS-3 mRNA在過敏性哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用機制進行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

鐘潔：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；陶寧：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；趙利：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；何誠：進行統計學分析；胡建平：課題設計，論文撰寫