新型冠狀病毒核酸提取與擴增試劑匹配的檢測結果分析

劉應芬，余昌秀，曹 玲，李青峰

(成都市公共衛生臨床醫療中心檢驗科，四川 成都 610016)

2019年12月以來，湖北省武漢市陸續發現了多例新型冠狀病毒(2019-nCoV)的肺炎患者，隨著疫情的發展，新型冠狀病毒引起了全中國乃至全世界的高度關注[1]。目前對2019-nCoV診斷起決定作用的任然是病毒核酸檢測分析[2]。然而，目前核酸檢測假陰性率仍然較高。假陰性的原因從檢測方面分析可能在于以下幾個方面，首先與試劑盒的特異性、靈敏度和穩定性相關，其次，試劑盒的質量有待進一步提高[3，4]。核酸檢測主要分為兩個步驟進行即核酸提取和核酸擴增。本研究擬通過對核酸提取試劑與擴增試劑是否匹配的檢測結果進行比較分析，評價試劑匹配與否的優劣，供實驗室參考，盡可能降低核酸檢測的假陰性率。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集本院2020年2月19日當天23例疑似和確診新冠患者的的咽拭子標本。

1.2 方法RNA的提取：分別采用達安全自動提取儀(提取試劑批號2019003，磁珠法)和圣湘手工RNA提取試劑(批號2020002，磁珠法)嚴格按照說明書進行提取。核酸擴增：按儀器使用說明或標準操作程序操作。達安：通道設置為通道1：FAM； 通道2：HEX； 通道3：TREA-RE；通道4：CY5，循環程序50 ℃15分鐘；95 ℃15分鐘，94 ℃15秒—55 ℃45秒45個循環；熒光收集在55 ℃。圣湘：通道設置為通道1：FAM； 通道2：HEX； 3：ROX，循環程序如下：50 ℃30分鐘；95 ℃1分鐘，95 ℃15秒—60 ℃30秒45個循環，25 ℃10秒冷卻；熒光收集在60 ℃。

1.3 結果判讀達安擴增試劑：如果檢測樣品在FAM通道和HEX通道無明顯擴增曲線或CT值>38，可判讀為2019-nCoV陰性；如果檢測樣品在FAM通道和HEX通道CT值≤38，且曲線有明顯的擴增曲線，可判讀為2019-nCoV陽性。圣湘擴增試劑：如果檢測樣品在FAM通道且ROX通道無明顯擴增曲線或CT值》40，HEX通道有擴增曲線，檢測CT值≤40，可判讀為2019-nCoV陰性；如果檢測樣品在FAM通道或ROX通道CT值≤40，且曲線有明顯的擴增曲線，可判讀為2019-nCoV陽性。

1.4 統計學方法本研究數據采用Excel 2007進行分析，通過計算各組合核酸檢出率來分析不同試劑組合的差異。率的比較采用卡方檢驗，P小于0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種試劑的基本資料達安試劑(A)和圣湘試劑(B)兩種試劑的基本情況見表1。兩種試劑中的RNA提取均采用磁珠提取法，檢測基因均為ORF1ab和N基因。

表1 兩種試劑的基本情況

2.2 檢測結果分析不同試劑匹配的檢測結果見表2和表3。用A提取的23份RNA加入A擴增試劑進行檢測，得到7例新冠核酸陽性，檢出率為30.43%；用B提取的RNA加入A擴增試劑進行檢測，得到4例新冠核酸陽性，檢出率為17.39%。用A提取的23份RNA加入B擴增試劑進行檢測，得到4例新冠核酸陽性，檢出率為17.39%；用B提取的RNA加入B擴增試劑進行檢測，得到8例新冠核酸陽性，檢出率為34.78%。匹配的試劑組檢出率高于交叉組。

表2 A擴增試劑的檢測結果

表3 B擴增試劑的檢測結果

3 討論

本研究比較了兩個公司的核酸提取試劑與核酸擴增試劑的匹配與否的檢測結果，結果顯示兩個公司自己的提取試劑匹配自己的擴增試劑檢測ORF1ab、N基因的檢出率高于核酸提取試劑與擴增試劑交叉檢測率。

對于新型冠狀病毒的檢測，我們嚴格按照中華人民共和國國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第三版)》對23例可疑和確診患者的咽拭子樣本進行檢測，結果表明兩家公司的試劑均可以檢測出ORF1ab基因和N基因，但是核酸提取試劑與核酸擴增試劑匹配不同，檢出率是有差異的。這種差異的原因之一可能與試劑引物設計有關，又一原因可能是各試劑盒受樣本本身的來源及其質量、樣本轉運條件、樣本預處理的影響不同而引起差異[5～7]。

新冠肺炎疫情是突發的公共衛生事件，各試劑廠商都是在極短的時間內完成試劑盒的研發和審批，試劑盒的質量和一些性能參數設置難免有不足之處，這對我們實驗室就要求更加嚴格的質量控制。各實驗室可根據自身情況，盡可能選擇能提高核酸檢出率的試劑盒，為臨床診斷治療提供更加可靠的依據。