胱氨酸尿癥的發病機制和基因治療前景

王政昊，白云金，曹德宏，唐 寅，王 佳，魏武然

(四川大學華西醫院泌尿外科，泌尿外科研究所，四川 成都 610041)

胱氨酸尿癥是以一種尿胱氨酸重吸收障礙為特點的常染色體隱性遺傳病[1]。以尿中高濃度胱氨酸為特點，其主要特征是尿液中排泄過量的L-胱氨酸和同時臨床可出現復發性胱氨酸結石，70%的結石復發患者最終發展為慢性腎病，9%甚至發展為終末期腎病[2]。現有結石防治措施僅能減少或延緩復發，不能達到根治效果。因此臨床急需尋求新的治療途徑。基因治療主要是通過分子生物學技術改變缺陷基因或調節其功能從而達到治療目的。目前在臨床疾病治療方面也已取得了突破性進展，特別是基因異常所致疾病，可起到延緩或治愈疾病的作用[3，4]。利用針對乙醇酸氧化酶的AAV8-CRISPR/Cas9載體用于高草酸尿癥小鼠，可以減少草酸的產生，緩解腎臟的損傷，顯著減少腎臟草酸鈣結晶產生，而且沒有副作用[5]。這些突破，為胱氨酸尿癥基因治療提供了可能。如能將治療基因選擇性地導入近端腎小管，糾正或彌補氨基酸轉運體的功能，可達到治療效果的同時大幅度減少治療的不良反應。本文針對胱氨酸尿癥的遺傳基礎和基因治療前景做一綜述。

1 胱氨酸尿癥的遺傳學基礎

尿中胱氨酸主要是通過腎小管刷狀緣的異二聚亞氨基酸轉運體被重吸收。該轉運體由兩個蛋白亞單位rBAT 和 b0，+AT組成[6]。rBAT 由位于 2 號染色體的 SLC3A1[7]編碼 (OMIM 104614)，而 b0，+AT 由 19 號染色體的 SLC7A9[8]編碼 (OMIM 604144)。若基因突變可導致85%的胱氨酸尿癥發生。但仍有15%的患者可能存在其他致病基因。腎小管rBAT表達具有區域性，主要在近端腎小管S3段，b0，+AT表達卻與之相反，主要表達在S1段。由此可見rBAT和b0，+AT在腎小管內大部分并不協同作用，具有空間表達差異。另外，b0，+AT屬于低親和力轉運體，單獨存在基本喪失生理功能，只有與rBAT協同表達才具有完整的氨基酸轉運體功能。推測近端腎小管S3段可能存在其他rBAT協作蛋白。近期研究發現膜蛋白AGT1/Slc7a13可能是rBAT第二轉運體，主要位于S3段腎小管細胞頂膜，與rBAT構成異二聚體，功能試驗證實AGT1可轉運胱氨酸、天冬氨酸和谷胱甘肽[9]。雖然臨床研究發現Slc7a13在胱氨酸尿癥患者中突變率高，但不是胱氨酸尿癥的致病基因[10]。因此，對于Slc3a1和Slc7a9基因表達正常的患者仍需進一步研究明確其致病基因。

2 腎臟基因治療現狀

腎臟解剖位置較深，組織細胞多樣性以及解剖結構復雜，導致腎臟基因治療相對滯后[11]。在腎臟疾病的基因治療中，轉染途徑和載體的選擇將是影響治療效果的關鍵步驟。將攜帶目的基因的載體注入血液系統后，幾乎全被肝臟和脾臟獲取，很少能夠到達腎臟[12]。另外腎臟本身解剖結構限制目前常用載體的應用。多數病毒載體直徑在20～200 nM，大于腎小球傳入小動脈直徑10 nM，而且許多載體分子質量大于腎小球濾過蛋白分子質量閾值50 kDa，均阻礙了載體傳遞[13]。腺病毒基因轉導效率較高是目前臨床基因治療常用載體[14]。全身使用時，基因基本在肝臟表達，腎臟表達很低，即使使用較高病毒量，亦不能達到有效表達量。由于病毒存在免疫原性，縮短了基因的表達時間。為了克服這些問題，目前采取兩種措施：其一，修飾改裝現有的病毒或非病毒載體；其二，直接靶向或局部使用載體，這種方式對于腎臟需侵襲性操作。因此目前靶向基因表達只限用與表淺組織或器官，比如眼睛或者呼吸系統。逆轉錄病毒可隨機整合到宿主細胞且可以長效穩定表達，但并不不能轉染非分裂細胞，然而腎小管細胞有絲分裂指數極低，因而逆轉錄病毒用于腎小管細胞轉染是不可行的。

2.1 腎臟基因治療載體傳遞途徑現有腎臟局部導入或傳遞載體的方法包括：經輸尿管腎盂注射[15]、腎靜脈注射[16]、腎實質注射[17]和腎動脈注射[18]。目前還沒有足夠的證據證明何種途徑能使腎臟長期有效表達外源基因。研究發現僅腎動脈傳遞相對具有較好的效果，能使腎小管和潤細胞轉導基因成功，但該技術具有操作難度。連續腎動脈泵入腺病毒，腎組織感染效果不理想，主要原因在于血液中存在免疫細胞，會限制病毒感染腎臟細胞[19]。通過腎靜脈注入載體，能夠少量表達在腎小球和近端腎小管，腎盂給藥主要是轉導進入集合管[16]，腎實質注射雖操作簡單，但僅在注射點周圍有所表達。而經過膀胱逆行注入腺病毒雖可以避免病毒載體進入血液循環，但效果不佳，而且可能導致腎小管損傷。

近期學者報道了一種類似于腎盂順行造影的方法，即經過腎實質腎盂注射攜帶特定基因的AAV-9可以使腎小管表達[20]。手術后三月檢測發現報告基因在腎皮質和髓質仍有表達，而腎小球無表達。分析發現基因有效轉導主要集中在表達AQP2的集合管，也可稀疏表達在近端腎小管。該手術的優點是：所導致的出血和溶液外泄等并發癥可接受，對輸尿管無明顯損傷，不會導致輸尿管梗阻，與逆行轉導外源基因效果相當。

2.2 載體修飾——攜帶特異性啟動子為了減少不良反應發生，轉染須是特異性的，要避免轉染到其他非靶細胞和器官。腎臟是由很多不同種類細胞組成，基因治療應該具有器官和細胞特異性。既往研究直接通過手術方式進行載體傳遞并未促進病毒感染特定細胞，因為腎臟由多種細胞類型組成。為了克服這一問題，通過修飾載體，使載體攜帶具有靶向性啟動子，從而有望實現靶向轉導。學者根據不同腎小管部位設計不同細胞特異性啟動子，啟動子驅動的定點表達特異蛋白可以特異性的表達在腎小管，而其他腎組織并無表達[19]，但插入腎臟特異性啟動子并不能增加轉導成功率[21]。值得一提的是，通過尾靜脈向使用環磷酰胺的小鼠體內注入睡美人轉座子可以明顯的減弱轉基因蛋白表達衰弱速度[21]。

2.3 超聲微泡作為載體超聲微泡是一種具有生物可降解性外殼包裹的不同氣體形成的球狀物質。隨著技術的不斷發展，目前其穩定性不斷增加、微泡直徑不斷降低、生物相容性也越來越好。隨著研究的深入，超聲微泡技術不僅用于臨床診斷，而且可以作為藥物遞送和基因治療的載體。與病毒相比，超聲微泡具備低免疫原性、可重復性和靶向性，并且可以保護基因不被核酸酶降解和機體清除。近年超聲靶向微泡破壞技術介導的基因遞送在糖尿病治療中已經取得很大進步，并有望用于臨床。

超聲微泡目前仍需解決的問題是尋找保證超聲微泡載體質量和提高轉染效率的策略。超聲微泡可以形成局部沖擊波，導致細胞膜瞬間形成小孔，從而提高腎臟細胞穿透性，毛細血管通透性也增加[22]，且具有可恢復性。超聲靶向微泡破壞技術介導的以超聲微泡為載體的基因轉染效率為40%左右。超聲破壞載SDF-1微泡靶向釋放SDF-1可提高腎臟SDF-1表達水平，促進移植的外源性間充質干細胞腎向歸巢能力，歸巢主要集中在腎小管周，有效延緩糖尿病腎病的進展[23]。超聲靶向微泡破壞技術聯合脂質體-輔酶Q10也可以改善糖尿病大鼠腎功能[24]。

3 胱氨酸尿癥基因治療困境

隨著近些年胱氨酸尿癥分子遺傳機制研究的深入，基因治療已成為可能。目前已經出現多種胱氨酸尿癥小鼠模型，這為后期研究胱氨酸尿癥的基因治療提供模型。雖然基因治療是胱氨酸尿癥較為理想的選擇，但仍要面臨眾多困難。由于腎臟結構的特異性，足細胞和腎小管細胞與血管之間存在基底膜，造成基因靶向導入的成功率大大減低。目前關于胱氨酸尿癥基因治療尚無報道。今后還需要尋求具有近端腎小管特異性的載體，同時保證高效的轉染率，能夠達到靶蛋白長效表達；另外，還要保證安全性，需要研制發現出無副作用、安全有效的載體。

綜上所述，隨著對胱氨酸尿癥認識的增加和分子生物學快速發展，胱氨酸尿癥基因治療成為可能，雖然胱氨酸尿癥基因治療還無相關報道，相信基因治療將會在胱氨酸尿癥疾病的治療中起到舉足輕重的作用。