甘蔗基蔗糖高附加值利用的研究進展*

田朝玉，楊建剛，朱玥明，孫媛霞

(中國科學院天津工業生物技術研究所，工業酶國家工程實驗室，天津 300308)

0 引言

食糖是食品工業的主要原材料，又是居民生活的消費必需品。我國是世界上第三大產糖國，僅次于巴西和印度，蔗糖占食糖總量的90%以上。甘蔗是蔗糖的主要原材料，廣西是全國甘蔗種植大省，種植面積和產糖量均占全國的60%左右。然而，受適蔗土地資源及環境氣候制約，與國際甘蔗種植相比，我國甘蔗生產集約化程度低，導致食糖成本高，平均每年進口蔗糖量占需求總量三分之一左右，且由于國際蔗糖到岸價格低廉，嚴重沖擊國內市場，制約甘蔗制糖產業的發展。蔗糖產業作為戰略儲備物資在國民經濟中占有重要地位，因此發展高附加值產品的綠色生產技術，提高甘蔗及其副產品的資源化利用水平具有重要意義。近年來，越來越多研究聚焦采用生物催化和微生物發酵技術轉化蔗糖以及糖蜜，研制有機酸、新型低熱量功能糖/糖苷、功能氨基酸等高附加值產品，提升產業優勢，為甘蔗制糖產業新經濟增長點開辟路徑。

1 甘蔗基蔗糖精制及各組分利用

甘蔗精制工業過程中，需要先將成熟的甘蔗物理加工提取蔗汁。甘蔗汁具有天然的營養、功能及風味成分，是制備風味糖漿的天然原料，而甘蔗糖漿已經用于雞尾酒調制、食品加工等領域[1]。將蔗汁加熱、沉淀、過濾，以除去非糖物質并降低蔗汁的黏度、色度，獲得清汁，然后經過蒸發濃縮和熬煮就可以制成糖膏，同時伴有蔗糖晶體的形成。將晶粒和母液分離，晶粒經干燥可制得高純度的精制紅糖和白糖產品。此外，蔗糖精制過程中會產生大量糖蜜，糖蜜通常呈深褐色，黏度較高且流動性較差，含有大量蔗糖和少量葡萄糖、果糖。

甘蔗精制蔗糖除廣泛應用于食品加工領域外，還可以作為原料轉化生產高附加值產品。近年來，隨著生物信息學、合成生物學、生物催化和微生物發酵等學科理論和關鍵技術的發展，已有眾多報道利用蔗糖制備精細化學品、功能糖及其衍生物、天然產物等，在食品、醫藥、化工領域具有潛在的應用。所采用關鍵技術主要分為兩大類：生物催化轉化技術和微生物發酵技術。

2 甘蔗基蔗糖的生物催化轉化技術

生物催化技術即采用篩選獲得的酶元件或者含有酶元件的細胞直接轉化蔗糖合成目標產品，該方法具有操作簡便、環境友好、轉化效率高、產物易于分離等優點。自然界中廣泛存在多種對蔗糖進行催化轉化的酶元件，根據BRENDA數據庫(https://www.brenda-enzymes.org/)記錄信息，直接參與蔗糖轉化相關的酶類有14種(表1)，已經被表征的酶催化元件不少于500種，這些關鍵元件的獲取為蔗糖生物轉化利用合成高附加值產品提供基礎。

表1 蔗糖利用相關酶匯總

Table 1 Summary of enzymes related to sucrose utilization

酶EnzymeEC號EC No.催化反應Reaction來源SourceUNIPROT文獻ReferenceLevansucrase2.4.1.10Sucrose+ [fructofuranosyl]n glucopyranoside= glucose+ [fructofuranosyl]n+1 glucopyranosideRahnella aquatilisO54435[2]Sucrose synthase2.4.1.13Sucrose+UDP=UDPglucose+fructoseArabidopsis thalianaP49040[3]Sucrosephosphate syn-thase2.4.1.14UDPglucose+fructose 6phosphate=UDP+sucrose 6phosphateOryza sativaA2WYE9[4]Alternansucrase2.4.1.140[glcglc]n+2sucrose=[glcglc]n+2+2fructofuranoseLeuconostoc mesenteroidesQ9RE05[5]Sucrose 6phosphate phosphorylase2.4.1.329Sucrose 6phosphate+phosphate=glucose1phosphate+fructose 6phosphateThermoanaerobacteri-um thermosaccharolyticumD9TT09[6]Sucrose phosphorylase2.4.1.7Sucrose+phosphate=fructose+glucose 1phos-phateBifidobacterium ado-lescentisQ84HQ2[7]Amylosucrase2.4.1.4Sucrose+[(14)glucosyl]n=fructose+[(14)glucosyl]n+1Neisseria polysacchareaQ9ZEU2[8]Dextransucrase2.4.1.5Sucrose+[(16)glucosyl]n=fructose+[(16)glucosyl]n+1Neisseria polysaccharea-[9]Raffinose synthase2.4.1.82Sucrose+galactinol=raffinose+inositolArabidopsis thalianaQ9FND9[10]Inulosucrase2.4.1.9Sucrose+[fructosyl]n=glucose+[fructosyl]n+1Lactobacillus reuteriQ8GP32[11]Sucrose:Sucrose fructosyl-transferase2.4.1.992sucrose=glucose+ fructofuranosylfructo-furanosylglucopyranosideFestuca arundinaceaQ9FSV7[12]Loliose synthase2.4.1.B1UDPgalactose+sucrose= UDP+lolioseLolium perenne-[13]Sucrosephosphate phos-phatase3.1.3.24Sucrose 6phosphate +H2O= sucrose+phos-phateZea maysQ9FQ11[14]Isomaltulose synthase5.4.99.11Sucrose=isomaltulose synthaseEnterobacter sp.FMB1B5ABD8[15]

蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖組成，因此采用生物催化技術利用蔗糖原料制備高附加值產品主要圍繞這兩種組分展開。針對蔗糖分子中果糖組分，開發最為成熟的技術是利用果糖轉移酶直接轉化蔗糖制備低聚果糖[16]。低聚果糖已被證實具有超強雙歧因子和水溶性膳食纖維的雙生理學特性，是目前研究較多、應用范圍較廣的益生元之一，在乳制品、飲料、糖果、面包、果凍等食品加工領域應用廣泛，全國平均每年產能超過萬噸；通過篩選新型菊糖果糖轉移酶，還可以獲得雙果糖酐[17]等新型低聚果糖組分。此外，將果糖基轉移酶催化蔗糖分解產生的果糖基轉移至乳糖還原末端，進而形成低聚乳果糖，是目前工業上制備低聚乳果糖的主要方法[18]。低聚乳果糖因其優良的加工特性和生理功能，被廣泛應用于食品工業領域，可以部分替代蔗糖。

蔗糖分子中的葡萄糖組分可以轉化為glucose 1-phosphate (G1P)和UDP-glucose (UDPG)兩種糖激活態中間體。前體G1P經糖苷轉移酶實現功能寡糖及其衍生物的生物合成，例如來源于Leuconostocmesenteroides的蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷[19]，該化合物是非洲神奇沙漠植物“不死草”密羅木的主要活性成分，具有高耐熱性、低吸濕性、高持水性、抗氧化性，可作為化妝品原料。蔗糖磷酸化酶還實現了葡萄糖基轉移合成稀有寡糖曲二糖[20]、葡萄糖基阿洛酮糖[21]、葡萄糖基丙二醇[22]等產物；此外，蔗糖磷酸化酶還可以與葡聚糖磷酸化酶偶聯制備合成淀粉，應用于制備可降解生物材料。蔗糖合成酶常用于天然產物的糖基化修飾，它可以催化蔗糖和UDP合成UDPG、果糖。Dai等[23]設計由蔗糖合成酶和糖基轉移酶組成的雙酶體系，實現新型人參皂苷Rh2和F12的生物制備，同時解決UDPG在天然產物糖基化修飾中的成本問題，具有潛在的應用前景。另外，蔗糖也可以作為全組分生物利用合成一些功能糖產物，最近研究發現淀粉蔗糖酶和蔗糖異構酶可催化蔗糖分子異構合成松二糖、海藻酮糖等產品，轉化率為40%-90%[24]。

由于蔗糖具有多個羥基，其經脂肪酶催化可以與有機酸反應形成蔗糖酯[25-26]，后者可充當抗菌劑、乳化劑使用并已應用于食品、紡織等行業中[27]。此外，也有學者報道使用蛋白酶催化蔗糖酯的合成，而且效率更高。例如使用來源于Bacilluslicheniformis的protease可用于合成蔗糖丙烯酸酯，經24 h反應后可以轉化90%的蔗糖[28]；王治丹[29]使用蛋白酶N合成蔗糖甲基丙烯酸酯，后者可在海藻酸鈉水溶液中形成凝膠，用作藥物緩釋劑參與潰瘍的治療。

上述生物轉化系統大都采用單酶或者雙酶圍繞蔗糖開展高附加值利用研究，主要集中在糖苷轉移、異構和酯化等幾類反應，造成產品種類受限。隨著生物信息學和合成生物學技術的發展，越來越多的酶催化元件和合成途徑被精準解析，基于酶元件設計和構建復雜的體外合成途徑，對實現原子經濟性利用轉化和獲得結構多樣性的產品具有重要意義。因此，相關研究組合氧化還原、異構、脫磷酸、核苷化以及糖苷轉移等生化反應，構筑熱力學驅動的多酶級聯催化技術，轉化蔗糖合成高附加值產物。例如，Zhong等[30]構建由嗜熱物種來源的蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇1-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶組成的四酶反應體系，基于纖維素結合蛋白構建蛋白復合體，解決反應體系中酶最適溫度不匹配問題，實現蔗糖的高效轉化合成肌醇，得率達到0.98 mol/mol。Tian等[31]基于核苷化、異構和轉苷反應構建多酶催化體系，篩選來源于擬南芥(Arabidopisisthaliana)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的蔗糖合成酶、UDP-葡萄糖4-差向異構酶、肌醇半乳糖合成酶、棉子糖合成酶和水蘇糖合成酶，構建多酶反應體系；為解決級聯催化過程中酶穩定性差和催化效率不匹配問題，優化酶使用量和底物濃度，采用分步級聯和循環轉化方式，成功轉化蔗糖合成肌醇半乳糖、棉子糖和水蘇糖3種寡糖，其中棉子糖產量達到128 g/L，為大豆寡糖的制備提供一種新的合成路線，后期可通過酶分子改造提供關鍵酶的熱穩定性和催化活性，從而提升工業化應用潛力。同時，多酶催化體系中還可以集成乙酰化、脫水、氨基化等生化反應，從而轉化蔗糖制備更多種類的高附加值產品(表2)。

表2 蔗糖的生物催化轉化利用

Table 2 Utilization of sugarcane-based sucrose through biocatalytic conversion

酶Enzyme產物Products產量/轉化率Production/Yield文獻Reference果糖基轉移酶Fructosyl transferase低聚果糖FOS57%[16]果糖基轉移酶Fructosyl transferase低聚乳果糖LOS224 g/L[18]蔗糖磷酸化酶Sucrose phosphorylase葡萄糖甘油Glucosyl glycerol203 g/L[19]蔗糖磷酸化酶Sucrose phosphorylase曲二糖Kojibiose104.45 g/L[20]

續表2

Continued table 2

酶Enzyme產物Products產量/轉化率Production/Yield文獻Reference蔗糖磷酸化酶、塔格糖3差向異構酶Sucrose phosphorylase,tagatose 3epimerase葡萄糖基阿洛酮糖Glucosylalluloside—[21]淀粉蔗糖酶Amylosucrase松二糖Turanose43.4%[24]淀粉蔗糖酶Amylosucrase海藻糖Trehalose81%[24]脂肪酶Lipase肉桂酸蔗糖酯Cinnamate sucrose ester-[25]蛋白酶Protease蔗糖丙烯酸酯Sucrose acrylate esters90%[28]蛋白酶Proteinase N蔗糖甲基丙烯酸酯Sucrose metharylate22.15%[29]菊粉蔗糖酶、菊粉果糖轉移酶Inulosucrase,inulin fructotransferase雙果糖酐Difructose dianhydride115 g/L[17]蔗糖合成酶、UDP糖基轉移酶Sucrose synthase,UDPglycosyltransferaseF123.98 g/L[23]蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇1磷酸合成酶、肌醇單磷酸磷酸酶Sucrose phosphorylase,phosphoglucomutase,inositol 1phosphate syn-thase,and inositol monophosphatase肌醇Inositol89.2 g/L[30]蔗糖合成酶、UDP葡萄糖4差向異構酶、肌醇半乳糖合成酶、棉子糖合成酶、水蘇糖合成酶Sucrose synthase,UDPglucose 4epimerase,galactinol synthase,raffinose synthase and stachyose synthase棉子糖Raffinose128 g/L[31]

3 甘蔗基蔗糖的微生物發酵技術

許多天然微生物具有代謝蔗糖的途徑。蔗糖轉運方式主要分為兩種，即磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶式(PEP-PTS) 和非磷酸轉移酶式(非PTS)[32-33]。在PEP-PTS體系中，磷酸烯醇丙酮酸作為磷酸鹽供體可以將蔗糖磷酸化并攝入細胞中，所得的蔗糖6-磷酸將被水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖；在非PTS體系中，蔗糖由蔗糖透過酶泵入胞內，隨后被蔗糖水解酶分解成葡萄糖和果糖，或者被磷酸化酶水解成葡萄糖-1-磷酸和果糖。相比之下，非PTS體系所需的組件更少，也比PEP-PTS更簡單。自然界中，并不是所有的微生物都能高效地攝入蔗糖，有的菌株甚至完全不能利用蔗糖，這是因為有的菌株沒有蔗糖轉運酶，蔗糖無法進入胞內。相關研究報道通過在工業菌株中引入蔗糖轉運蛋白，利用蔗糖合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)[34]。

蔗糖在微生物體內轉化為細胞生長所需的能量ATP和中間代謝產物，或者轉化為次級代謝產物。近年來，隨著生物工程技術的不斷發展，學者們對宿主細胞的合成代謝途徑進行重構，引入各種蔗糖外源高效轉化和利用的元件，成功創建一系列細胞工廠，可以高效地將蔗糖轉化為多種精細物質(表3)。

3.1 化學品

近年來相關研究報道采用蔗糖作為原料，通過菌株改造，發酵法合成葡萄糖二酸[35]、丁醇[36]等化學品，尤其是Xin等[37]以克雷伯氏菌為出發菌株，嘗試用葡萄糖、甘油、木糖和蔗糖4種廉價碳源合成2,3-丁二醇，研究發現采用蔗糖發酵時，2,3-丁二醇產量最高達到119.4 g/L，產率為2.18 g·L-1·h-1。

3.2 氨基酸及其衍生物

當前已有研究報道采用經代謝工程改造的谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum發酵蔗糖合成賴氨酸和谷氨酸。例如Kiefer等[38]比較葡萄糖、果糖和蔗糖發酵對賴氨酸合成的影響，采用葡萄糖發酵的賴氨酸產物得率(C-mol/C-mol)比蔗糖高8%，但是在菌株中增強果糖1,6-二磷酸酶的表達強度后，蔗糖發酵獲得賴氨酸和谷氨酸的得率提高近3倍，證實果糖1,6-二磷酸酶在蔗糖發酵生產賴氨酸和谷氨酸中起到關鍵作用。除此之外，研究發現未經遺傳操作的干酪乳桿菌Lactobacillussakei發酵含有蔗糖的米糠抽提液培養基，可將12%的谷氨酸全部轉化為γ-氨基丁酸，產量達到68.1 g/L，轉化率達到100%，并實現5 000 L的轉化反應，具有較強的應用潛力[39]。

3.3 功能單糖及糖醇

蔗糖經蔗糖酶水解之后生成葡萄糖和果糖，后者可經全細胞催化轉化合成功能單糖及糖醇。Yang等[40]設計基于蔗糖酶和阿洛酮糖3-差向異構酶的轉化路線，篩選來源于嗜熱菌株Thermotogamaritima的蔗糖酶和類芽孢菌屬Paenibacillussenegalensis的阿洛酮糖3-差向異構酶，構建食品級表達體系，采用全細胞固定化方法，分級轉化實現蔗糖轉化合成阿洛酮糖，生產效率達到18.6 g·L-1·h-1。除此之外，蔗糖酶水解蔗糖為葡萄糖和果糖后，甘露醇脫氫酶可催化果糖轉化為甘露醇。相關研究采用來源于植物乳桿菌Lactobacillusplantarum的蔗糖酶和布氏乳桿菌Lactobacillusbuchneri的甘露醇脫氫酶，構建雙酶共表達菌株，優化發酵條件，甘露醇產量達到45.19 g/L，轉化率為37.66%，與乳酸菌直接發酵蔗糖生產甘露醇相比，產量提高6倍[41]。

3.4 功能寡糖

蔗糖還可用于發酵合成功能寡糖及其衍生物。Yun等[42]將Aureobasidiumpullulans細胞固定化，采用半連續發酵的方法將蔗糖轉化為低聚果糖，并且經過循環使用60次后仍不影響轉化效果；Roenneke等[43]通過對谷氨酸棒桿菌的代謝通路重構，轉化蔗糖合成甘油葡萄糖苷，通過優化供體、氮源限制等因素，將甘油葡萄糖(α-GG)的產量提升至2 g/L。

3.5 多糖

研究發現芽孢桿菌[44-45]可以發酵蔗糖合成Levan果聚糖， Levan果聚糖具有抗腫瘤、免疫調控、抗感染等作用，還可以作為血漿的替代品。張麗姣等[46]篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌PB6，可發酵蔗糖合成胞外多糖，通過單因素和響應面實驗優化發酵條件，果聚糖產量達到104 g/L；隨后研究者對所獲得果聚糖進行乙酰化、磺酰化和硫酸化修飾，發現經化學修飾后，產物的抗氧化性和抗腫瘤活性與未經修飾的果聚糖相比顯著提高。除果聚糖，土壤農桿菌屬Agrobacterium還可以發酵蔗糖合成凝膠多糖，產量達到60 g/L，已經被美國FDA于1996年準許將其作為食品穩定劑、增稠劑用于食品配料中[47]。Letisse等[48]使用XanthomonascampestrisATCC13951以蔗糖為唯一碳源進行發酵產黃原膠，轉化率可達60%。黃原膠主要由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸構成，由于具有很強的親水性和保濕性，已被廣泛應用于醫藥、食品等領域。

4 甘蔗糖蜜的高附加值利用

甘蔗糖蜜又叫桔水。作為一種甘蔗精制工業副產物，由于其含有大量糖類，常常直接用作飼料使用[49]；與此同時，糖蜜還可以用作發酵培養基或輔料，目前報道最為廣泛的是釀酒酵母發酵糖蜜生產生物乙醇[50-51]。除此之外，微生物法發酵糖蜜還用于合成其他大宗化學品(表3)，有效降低原料成本。例如Liu等[52]使用Actinobacillussuccinogenes厭氧發酵糖蜜生產丁二酸，發酵60 h，產量達到50.6 g/L；后經發酵優化，丁二酸的產量和產率進一步提高，最終產量為55.2 g/L；Chen等[53]采用工程E.coliKJ122發酵也達到類似的產量。野生型Lactobacillusdelbrueckii經紫外誘變后，具有較強的蔗糖糖蜜耐受性和乳酸生產能力，且乳酸的產量與糖蜜的添加量密切相關，當糖蜜添加到190 g/L時，乳酸的產量達到166 g/L[54]。聚羥基丁酸(PHB)是一類可降解生物材料，在工業上具有廣泛應用前景，然而目前發酵生產PHB原料成本占據總成本50%。Akaraonye等[55]采用BacilluscereusSPV發酵蔗糖糖蜜生產PHB，產量為4.0 g/L，占細胞干重的60%以上。此外，也有利用糖蜜生成丁酸[56]、檸檬酸[57]的報道。

除發酵糖蜜生產大宗化學品，也有相關研究報道利用糖蜜制備功能性碳水化合物。Yang等[40]成功利用蔗糖糖蜜合成阿洛酮糖，產量達到61.2 g/L。Cazetta等[58]以糖蜜為底物，利用菌株Zymomonasmobilis發酵合成山梨醇，在35℃、常壓下可合成得到13.9 g/L產物。該法使用的底物成本更低，因而優勢更加明顯。此外，Keshk等[59]嘗試利用微生物發酵糖蜜生產細菌纖維素，通過對發酵菌株篩選，得到一株最優產纖維素菌株AcetobacterxylinumIFO 13772，在培養基中發酵7 d，可以獲得173.7 mg/L纖維素。另外，陳軍等[60]采用硫酸-熱處理糖蜜，更適合于纖維素的合成，使用紅茶菌發酵可以制備12.0 g/L細菌纖維素。

表3 蔗糖及糖蜜的微生物發酵利用

Table 3 Utilization of sugarcane-based sucrose and molasses through microbial fermentation

菌株Strains產物Products產量Production(g/L)文獻ReferenceE.coli WPolyhydroxyalkanoate,PHA113[34]E.coli葡糖二酸dglucaric acid1.42[35]Clostridium tyrobutyricum丁醇nButanol16[36]Klebsiella sp.丁二醇2,3butanediol119.4[37]Corynebacterium glutamicum賴氨酸Lysine2.66[38]Lactobacillus sakeiγ氨基丁酸γaminobutyric acid68.1[39]Corynebacterium glutamicum阿洛酮糖Allulose225[40]E.coli甘露醇Mannitol45.2[41]Aureobasidium pullulans低聚果糖FOS-[42]Corynebacterium glutamicum甘油葡萄糖αglucosylglycerol,αGG2.0[43]Bacillus amyloliquefaciens果聚糖Levan104[46]Agrobacterium sp.凝膠多糖Curdlan60[47]Xanthomonas campestris ATCC13951黃原膠Xanthan gum25[48]Actinobacillus succinogenes丁二酸Succinic acid55.2[52]Lactobacillus delbrueckii乳酸Lactic acid 166[54]Bacillus cereus SPVPoly (3hydroxybutyrate),PHB4.0[55]Clostridium tyrobutyricum丁酸Butyric acid55.2[56]Aspergillus niger GCMC7檸檬酸Citric acid106.7[57]Zymomonas mobilis山梨醇Sorbitol13.9[58]Acetobacter xylinum IFO 13772纖維素Bacterial cellulose12.0[60]

5 展望

盡管甘蔗基蔗糖生物轉化利用合成高附加值產品取得顯著成績，但是依然有若干方向亟待突破。首先，當前生物催化技術大都只利用蔗糖中的葡萄糖或者果糖組分，造成碳原子浪費，今后研究中可組合兩種或者多種酶催化技術，實現蔗糖的全組分利用，提高碳原子經濟性；其次，當前使用糖蜜發酵會大幅度降低生產成本，但是由于其成分復雜，與蔗糖發酵相比產物產量通常較低，且前期需要復雜的處理工藝，成本高，后續研究中可篩選一些耐高鹽、耐高滲、環境適應能力強的酶催化元件或者微生物，直接發酵糖蜜制備目標產品；再次，盡管蔗糖生物轉化利用獲得多種附加值產品，但是其市場潛能尚未完全開發，后期研究中可探索和宣傳已開發產品的生理功能，提升市場認可，促進蔗糖產業升級。