四妙丸HPLC 指紋圖譜建立

夏 婷，陳飛龍，崔媛媛，譚曉梅

（南方醫科大學中醫藥學院，廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東省中藥制劑技術工程實驗室，廣東 廣州510515）

四妙丸由蒼術、牛膝、黃柏、薏苡仁組成，收錄于2015 年版《中國藥典》，用于治療濕熱下注所致的痹病，癥見足膝紅腫、筋骨疼痛等［1］。其中，蒼術主要由揮發性成分組成，以蒼術素、蒼術醇、白術內酯等化合物為主［2］；黃柏的活性成分為生物堿，小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿［3-4］；牛膝中主要成分為多糖類、皂苷類、植物甾酮類和黃酮類［5］；薏苡仁的主要成分包括脂肪酸及酯類、薏苡素、糖類、黃酮類、糖蛋白類、甾醇類和內酰胺類等［6］。

目前，四妙丸的指紋圖譜研究較少，現有四妙丸指紋圖譜存在單波長、分離度差、共有峰與指認峰少、沒有對牛膝與薏苡仁藥材進行峰歸屬等問題［7-10］，無法全面表征四妙丸的化學成分。本研究運用HPLC 切換波長法建立了四妙丸指紋圖譜，將四妙丸復方進行成分歸屬；通過相似性評價、聚類分析和主成分分析對11 批四妙丸研究，以期為四妙丸的綜合質量評價提供參考。

1 材料

儀器Agilent1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；CP324S 電子天平（德國Sartorius 公司）；KH-500DB型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。阿魏酸（批號110773-201614）、鹽酸小檗堿（批號110713-201814） 均購于中國食品藥品檢定研究院；巴馬汀（批號AF8072606）、黃柏堿（批號AF8062901）、木蘭花堿（批號AF8091802）、蒼術素（批號AF9030305） 均購于成都埃法生物有限公司；綠原酸（批號16031610）、藥根堿（批號16061613） 均購于寶雞市辰光生物有限公司。乙腈（色譜純，美國默克公司）；磷酸（色譜純，上?？泼軞W有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純；藥材信息與11 批四妙丸（規格為每15 粒重1 g） 樣品來源信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1%磷酸，梯度洗脫（0～30 min，7%～18% A；30～45 min，18%～22.5% A；45～50 min，22.5%～24% A；50～55 min，24%～48% A；55～65 min，48%～51%A；65～85 min，51%～70%A；85～90 min，70%～7% A）；波長 （0～65 min，280 nm；65～90 min，330 nm）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。

2.2 對照品溶液制備 取綠原酸、黃柏堿、木蘭花堿、阿魏酸、藥根堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿、蒼術素對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1 mL 含綠原酸、黃柏堿、木蘭花堿、阿魏酸、藥根堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿、蒼術素各50 μg 的混合溶液，即得。

2.3 四妙丸供試品溶液制備 將四妙丸研成細粉，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲 （300 W，40 kHz） 處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用50% 乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 單味藥材供試品溶液制備 按藥典中四妙丸比例分別取蒼術、牛膝、黃柏、薏苡仁0.15、0.15、0.3、0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50% 乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲 （300 W，40 kHz） 處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用50% 乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取同一份“2.3” 項下四妙丸供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下連續進樣6 次，以24 號峰（鹽酸小檗堿） 為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取同一批四妙丸樣品 （批號190101），按“2.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣，以24 號峰（鹽酸小檗堿） 為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于1.9%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取同一份“2.3” 項下四妙丸供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，以24 號峰（鹽酸小檗堿） 為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于1.7%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6 指紋圖譜建立 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版軟件對11 批四妙丸樣品數據進行處理，生成對照特征圖譜；通過對特征峰的識別和指認，得到的四妙丸HPLC 特征圖譜共有色譜峰31 個，其中峰6、9、10、16、21、23、24、31 分別與綠原酸、黃柏堿、木蘭花堿、阿魏酸、藥根堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿和蒼術素對照品峰的保留時間相對應，且紫外光譜圖一致，混合對照品色譜圖與四妙丸樣品圖見圖1。以24 號峰（鹽酸小檗堿） 為特征S峰，11 批四妙丸共有峰的相對保留時間及相似度，見表2～3、圖2。結果表明，11 批 四妙丸樣品相似度大于0.994。對四妙丸樣品與單味藥進行比較分析，結果見圖3，2 號峰來源于牛膝，7、9、10～24 號峰均來源于黃柏，25～31 號峰來源于蒼術，6 號峰來源于黃柏和蒼術。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

表2 11 批樣品共有峰相對保留時間結果

續表2

表3 11 批樣品相似度結果

2.7 聚類分析 將11 批樣品共有峰的峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，得到聚類分析圖，見圖4。11 批四妙丸分為2類，第Ⅰ類包括批號為171107、171108、171211、180111、180112 的樣品；第Ⅱ類包括 批號為171111、180603、180901、180717、181218、190101 的樣品。聚類分析結果可知，不同批次的四妙丸化學成分含有量存在差異。

2.8 主成分分析 將11 批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件分析軟件，結果見表4、圖5。表4 顯示，1～6 號成分的特征值大于1，累計方差貢獻率為95.142%，表明這6 種成分可以反映原始變量的大部分信息，因此，可將其作為主成分進行分析。圖5 表明，11 批樣品可根據離散程度分為兩類。主成分分析結果與聚類分析結果一致，表明不同批次樣品間化學成分存在差異。

圖2 11 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖3 四妙丸各成分歸屬

圖4 11 批樣品聚類分析

表4 主成分分析特征值和累計方差貢獻值

圖5 11 批樣品主成分分析

3 討論與結論

實驗通過3D 掃描圖得到色譜圖在0～65 min 波長為280 nm 得到的色譜峰較多，在65～90 min 波長為330 nm 得到的色譜峰較多，故選用檢測波長為280 nm （0～65 min）、330 nm （65～90 min）；考察了不同流動相（水-乙腈、磷酸-甲醇、磷酸-乙腈）、不同柱溫（25、30、35 ℃）、不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL／min），最終確定最佳色譜條件。

選用超聲提取法，通過考察超聲功率 （200、300、400 W）、超聲時間（15、30、45 min）、提取溶劑（水、甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、無水乙醇）、溶劑體積（25、50、100 mL） 和取樣量（0.5、1.0、1.5 g） 確定了供試品最佳前處理條件。

薏苡仁藥理作用的主要成分為油酯類與多糖類［11-12］，目前油酯類的檢測技術為蒸發光檢測器［13］，多糖的測定采用分光光度法在490 nm 處進行測定［14］。綜合考慮四妙丸的整體化學成分，本實驗采用HPLC-DAD 檢測器建立指紋圖譜，該方法尚不能檢測到薏苡仁藥材的成分。在今后的研究中，可考慮采用多技術、多儀器對四妙丸質量控制進行全面評價研究。

本實驗建立四妙丸HPLC 指紋圖譜，該方法具有分離效果好，化合物信息豐富，樣品處理簡單，可用于四妙丸的質量控制。