白藜蘆醇對代謝綜合征大鼠糖脂代謝的改善作用

繆 萍，周 飛，王邦才，張 斌

（1.寧波市鄞州人民醫院，浙江 寧波315040； 2.寧波大學醫學院，浙江 寧波315211； 3.寧波市中醫院，浙江 寧波315010）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS） 是以中心性（腹型） 肥胖、高血壓、血脂異常、糖尿病或糖耐量受損等多種代謝性疾病聚集出現為特點的一組臨床癥候群［1］，以胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 為共同病理基礎［2］，已成為全球公共健康主要問題。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK） 是一種細胞和機體的“能量調節器”，被激活的AMPK 有助于糾正代謝紊亂，使之趨向生理平衡，成為治療多種代謝性疾病的新靶點［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res） 是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛分布于虎杖、葡萄、花生等多種植物中，具有降脂、保肝、抗炎、抗氧化及調節免疫等藥理活性［4］。本研究擬采用高脂高鹽高糖飲食誘導大鼠MS 模型，圍繞AMPK 信號傳導通路的關鍵環節，探討白藜蘆醇改善糖脂代謝的可能作用機制。

1 材料

1.1 動 物 SPF級雄性SD大鼠32只，體質量（200±20） g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，生產許可證號SCXK （浙） 2014-0001，飼養于寧波大學實驗動物中心，自由進食飲水。

1.2 藥物與試劑 白藜蘆醇 （純度為99.88%，批號FY10700805） 購自江蘇南通飛宇生物科技有限公司，用純水配制成質量濃度為20 mg／mL 的混懸液；鹽酸二甲雙胍片（國藥準字H20023370） 購自中美上海施貴寶制藥有限分司，使用前用蒸餾水配成質量濃度為30 mg／mL 的溶液，以上藥液均置于4 ℃冰箱保存。高脂高鹽高糖飼料購自北京科澳協 力飼料 有限公 司；空腹血 糖 （FPG，批 號151041-01）、空腹胰島素（FINS，批號21587103）、總膽固醇 （TC，批 號 2175701）、甘油三 酯 （TG，批 號22259201）、高密度脂蛋白（HDL-C，批號621827-01）、低密度脂蛋白（LDL-C，批號618989-01） 試劑盒購自瑞士羅氏公司；RNA 抽提試劑盒（批號1701G14） 購自上海捷瑞生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒（批號7E092G6）、熒光定量PCR 試劑盒（批號7E092H6） 均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型，批號P0010S）、RIPA裂解液（批號P0013B） 均購自江蘇碧云天生物技術研究所；乙酰輔酶A 羧化酶（ACC，批號4190S） 抗體購自美國CST 公司；脂肪酸合成酶（Fas，批號SC1023） 抗體購自美國Santa 公司。

1.3 儀器 BW-NIBP1106 型無創血壓測量系統（上海軟隆科技發展有限公司）；C501 全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）；SMA 4000 微量紫外分光光度計（美國Merinton公司）；SCIENTZ-48 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Spectra Max Plus 384 酶標儀 （美國Molecular Devices 公司）；CFX connect 熒光定量PCR 儀、Mini-Proten Tetra System 電泳系統、ChemiDoc XRS 凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad 公司；Avanti J-E多用途高效離心機（美國Beckman 公司）；XS-105電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；超低溫冰箱（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模 采用高脂高鹽高糖飼料（基礎飼料56%+豬油15%+蔗糖15%+蛋黃10% +食鹽2% +膽固醇2%） 喂養16周建立MS 模型。

2.2 分組、給藥 大鼠適應性飼養7 d 后，按隨機數字表法分為正常組、模型組、白藜蘆醇組、二甲雙胍組，每組8 只。參考文獻 ［5］，制定白 藜蘆醇 給藥劑量為100 mg／kg，二甲雙胍根據成人臨床日用量，按體表面積折算動物有效劑量，給藥劑量為150 mg／kg，正常組和模型組給予蒸餾水，給藥體積為5 mL／kg，1 次／d，連續4 周。每天觀察大鼠的一般情況（精神狀態、活動、進食量和皮毛等），每周測定體質量。

2.3 取樣 末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹腔注射25%烏拉坦（4 mL／kg） 麻醉，腹主動脈取血，3 000 r／min離心20 min，分離血清，-70 ℃保存備用。分離腸系膜、雙側附睪旁和腎周脂肪組織，預冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱定質量，并記錄。剪取肝臟左葉相同部位組織，-70 ℃凍存待檢。計算體脂比＝ （腹腔脂肪質量／體質量） ×100%。

2.4 血壓測定 大鼠安靜狀態下監測尾動脈血壓，平行測量3 次，取平均 值，記錄收縮壓 （SBP） 和舒張 壓（DBP），每周測量1 次。

2.5 血清指標檢測 按試劑盒說明書檢測血清FPG、FINS、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。計算胰島素抵抗指數 （HOMA-IR） ＝ ［FPG （mmol／L） × FINS （mIU／L）］ ／22.5。

2.6 qRT-PCR 法檢測肝 臟AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達 TRIzol 法提取總RNA。逆轉錄合成cDNA，反應條 件為50 ℃、15 min，85 ℃、2 min。引物序 列，AMPKα正 向 5′-CAA CAAGCCCACCCGATTC-3′，反 向5′-TGC CACTTTGCCTTCCGT-3′，163 bp；ChREBP正 向5′-GCAACTGAGGGATGA AATAGAGG-3′，反向5′-TCAAA TAAAGGTCGGATGAGGA-3′ （R），195 bp；SREBP-1 正向5′-TTGAGGATAACCAGGTGAAAGC-3′，反向5′-TCAGAGGGAGTG AGGATGCC -3′，154 bp；β-actin正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TCAGAG GGAGTGAGGATGCC-3′，150 bp。擴增反應程序為95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個循環。結束后進入融解曲線采集程序，從70 ℃開始每5 s 將溫度提高0.5 ℃并采集熒光信號，直至溫度達到95 ℃。以β-actin為內參，采用Livak（2-△△ct） 法進行相對基因表達分析。

2.7 Western blot 法檢測肝臟ACCα、Fas 蛋白表達 用RIPA 裂解液提取肝臟組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 樣品，SDS-PAGE 電泳，PVDF 轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液搖床洗膜后加二抗（1 ∶5 000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液反復洗后，ECL 發光顯色，凝膠成像儀曝光成像。Image J 軟件分析條帶灰度值，并進行半定量分析處理。

2.8 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件，數據以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀態 正常組活動敏捷、反應靈敏、毛發光澤、體質量逐漸增加、大便呈顆粒狀，模型組動作遲緩、反應遲鈍、皮毛蓬亂、光澤度變差、后期出現脫毛、大便質軟、飲水量增多、體質量增加（P＜0.01）、腹腔脂肪堆積（P＜0.01）、體脂比升高（P＜0.01）。給藥組狀態較模型組有所改善，體質量、腹腔脂肪質量及體脂比均下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量、腹腔脂肪質量及體脂比比較（， n＝8）

表1 各組大鼠體質量、腹腔脂肪質量及體脂比比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

3.2 大鼠血壓 與正常組比較，模型組大鼠血壓SBP、DBP 升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇、二甲雙胍均能降低SBP、DBP （P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

3.3 大鼠血糖及胰島素 與正常組比較，模型組大鼠血清FPG、FINS 水平及HOMA-IR 升高（P＜0.01），與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組上述指標均降低（P＜0.01）。見表3。

3.4 大鼠血脂 與正常組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-C 水平升 高，而 HDL-C 水平降 低 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇在一定程度上改善脂質異常，主要是降低LDL-C 水平，提高HDL-C 水平（P＜0.05），但對TC 影響不大。見表4。

表2 各組大鼠血壓比較（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

表2 各組大鼠血壓比較（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

注： 與正常 組比較，?? P ＜ 0.01；與模型 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.5 大鼠肝 臟AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達 與正常組相比，模型組大鼠肝組織AMPKαmRNA 表達降低 （P＜0.01），ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達增 加（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組均能上調AMPKαmRNA 表 達 （P＜0.05，P＜0.01），降 低ChREBP、SREBP-1 mRNA 表達（P＜0.01）。見圖1。

表3 各組大鼠血糖及胰島素水平比較（， n＝8）

表3 各組大鼠血糖及胰島素水平比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與白藜蘆醇組比較，#P＜0.05。

表4 各組大鼠血脂水平比較（mmol／L，， n＝8）

表4 各組大鼠血脂水平比較（mmol／L，， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

圖1 各組大鼠肝組織AMPKα、 ChREBP、 SREBP-1 mRNA 表達比較（n＝5）

3.6 大鼠肝臟ACCα、Fas 蛋白表達 與正常組比較，模型組大鼠肝臟ACCα、Fas 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組、二甲雙胍組均能抑制ACCα、Fas蛋白表達（P＜0.05）。見圖2。

4 討論

圖2 各組大鼠肝組織ACCα、Fas 蛋白表達比較（n＝8）

本實驗采用高脂高鹽高糖飼料喂養構建MS 模型，旨在模擬人類營養性肥胖代謝紊亂的自然病理過程。研究結果提示，該模型具有腹型肥胖、高血壓、血糖血脂異常、高胰島素血癥等特征。經白藜蘆醇干預后，能有效控制體質量和血壓，明顯降 低血清FBG、FINS、HOMA-IR、LDL-C水平，提高HDL-C 水平，改善IR，使機體的糖脂代謝趨于正常。

MS 的發病涉及IR、糖脂代謝、氧化應激和炎癥反應等多個機制，且各機制之間相互影響、相互促進。近年來研究［3］表明，AMPK 信號通路轉導異常引起糖脂代謝紊亂是MS 發生發展的重要環節。AMPK 是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，由催化亞單位α 和調節亞單位β、γ 組成，廣泛存在于骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪組織中。其最主要的生物學效應是通過感受胞漿內AMP／ATP 比值的變化進行調節，控制產能的分解與合成代謝通路，保證細胞能量的供應。國外學者研究［6］證實，在食物攝入量相同的情況下，與正常組相比，AMPKα2 基因敲除小鼠的體質量和脂肪組織含有量均增加。當應激反應（如局部缺氧缺血、運動、饑餓和熱休克等） 發生時，細胞感受到能量危機，通過ATP 產生減少或利用增加，使細胞內AMP／ATP 的比值上升，從而激活AMPK。被活化的AMPK 通過多條信號通路對機體糖脂代謝發揮著重要的調控作用，主要通過磷酸化抑制ACC 活性，從而抑制脂肪酸的合成，并增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化［7］；同時激活的AMPK作為SREBP-1 的上游激酶，可抑制其轉錄，阻斷脂肪酸和TG 合成相關酶的表達［8］；誘導葡萄糖轉運蛋白（GLUT-4）表達，促進外周組織葡萄糖的攝取，增加胰島素敏感性［9］。

SREBPs 是調控脂質合成的重要轉錄因子家族［10］，它有3 種形式的異構體（SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2）。其中SREBP-1 主要參與脂肪酸和TG 的合成，能夠促進脂肪酸從頭合成途徑中的關鍵酶ACCα、Fas 的表達。若SREBP-1 過度表達，將導致脂質在肝臟、血管和胰島等非脂肪組織中異常積聚，從而誘發肥胖、2 型糖尿病和脂肪肝等代謝類疾病［11］。ChREBP 是堿性螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈（bHLH／ZIP） 轉錄因子Mondo 家族成員［12］，它的靶標主要是與糖酵解、糖異生和脂質生成相關的酶類，包括肝丙酮酸激酶（LPK）、磷酸果糖激酶 （PFK）、ACC 和Fas 等，在機體脂質代謝和葡萄糖穩態的調控中發揮關鍵作用。SREBP-1 和ChREBP 協同發揮作用，調節脂質合成相關酶（如ACC、Fas、SCD1） 的表達。

研究［13］發現，針對AMPK 靶點的藥物有助于MS 的預防和治療。臨床上常用的二甲雙胍是AMPK 激活劑［14］，可改善2 型糖尿病KKAy 小鼠糖耐量異常，促進胰島β 細胞分泌，減輕肝臟脂肪沉積［15-16］。本研究結果顯示，與模型組比較，白藜蘆醇同樣能明顯提高MS 大鼠肝臟AMPKα 活性，降低下游靶分子ChREBP、SREBP-1 mRNA 和ACCα、Fas 的蛋白表達，進而改善脂質和糖代謝失衡，延緩MS 的發展進程。