HPLC 法同時測定九龍盤中6 種成分

李 俊，盧汝梅，黎云清，梁臣艷

（廣西中醫藥大學，廣西 南寧530200）

九龍盤為蓼科金線草屬植物金線草Antenoron filiforme（Thunb） Rob.et Vaut.的全草，具有通氣道、谷道，調龍路，清熱毒，散瘀止痛之功效。壯族民間常用于治療埃病（咳嗽）、阿意咪（痢疾）、埃嘞（咳血）、發旺（風濕骨痛）、林得叮相（跌打損傷） 等［1］。研究發現金線草中主要有黃酮類、香豆素、酯類、植物蛻皮甾醇類等，其藥理學作用也十分廣泛，有抗菌消炎、抗腫瘤、止血、抗病毒、抗氧化等作用［2-5］。研究通過采用顯微鑒別和薄層色譜的方法對金線草進行定性鑒別，確定其質量標準［6-8］。且目前主要研究了黃酮類化合物的藥理作用。目前對九龍盤的相關研究報道較少，《廣西壯族自治區壯藥質量標準》 收載了九龍盤的質量標準，但僅有沒食子酸的含有量測定［9］，指標成分專屬性和相關性不強。李兵等［10］采用HPLC法測定了其中沒食子酸的含有量，開展鑒別和檢查項目研究，制定九龍盤的質量標準。樊寶娟等［11-12］測定了金線草中β -谷甾醇、胡蘿卜苷和沒食子酸的含有量，對九龍盤化學成分的質量控制主要表現在單個化學成分的質量控制，不能全面反映藥材的整體質量。Zhao 等［13］從金線草中分離鼠李素-3-O-β-D-半乳吡喃苷、豆甾醇、3-β-谷甾醇等11 個化合物。Ma 等［14］從金線草中分離得到1，3-di-O-p-coumaroyl-2′，6′-di-O-acetylsucrose、quercetin 3-O-β-D-apiofuranoyl-（1→2） -α-L-rhamnopyranoside等2 種新的酚類成分和9 種已知化學成分。

近年來，本課題組對九龍盤的化學成分進行研究［15-16］，分離得到沒食子酸、圣草酚等22 個化合物；并開展了九龍盤中鎮痛抗炎藥理作用研究。本實驗采用HPLC 法，對前期提取分離得到的沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素6 種成分進行含有量測定，以期為全面評價藥材質量，提升藥材質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀，DAD檢測器（美國安捷倫公司）；UV-1780 型紫外分光光度計 ［島津企業管理 （中國） 有限公司］；CPA225D 型電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；Direct-QR5UV 型自動純水蒸餾器 （廣西南寧市博美生物科技有限公司）；RT-01 型粉碎機（上海羅技機械設備有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；水為超純水，其余試劑為分析純。對照品沒食子酸（批號Y19M8C36143）、原兒茶酸（批號Z30M6L1）、異槲皮苷（批號P25J9F65872）、鞣花酸 （批 號 S02N7G24008）、木犀草 素 （批 號C24M8Q36543，純度≥98%） 均購自上海源葉生物科技有限公司；槲皮素 （批號150206，純度≥98%） 購于上海如吉生物科技有限公司。九龍盤藥材經廣西中醫藥大學梁子寧教授鑒定為蓼科植物金線草Antenoron filiforme（Thunb） Rob.et Vaut.的干燥全草。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 COSMOSIL 5C18-PAQ 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） -0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，程序見表2；雙波長切換檢測；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素粉末適量，分別置于5 mL 量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，制成每1 mL 含6 種成分依次為1.08、1.15、1.08、0.08、1.13、1.10 mg 的對照品貯備液。精密吸取各對照品貯備液適量，置于25 mL 量瓶中，80% 甲醇稀釋至刻度，配置成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取九龍盤藥材粉碎，過3號篩，稱取3 g 粉末，精密加入80%甲醇100 mL，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質量，用80% 甲醇補 足減失 的質量，搖 勻，濾 過。經0.22 μL 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 系統適用性試驗 精密吸取對照品溶液及其供試品溶液各10 μL，分別測定，結果顯示，在“2.1” 項色譜條件下，各待測成分間均能達到基線分離，且分離度均＞1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.5 線性關系考察 精密吸取上述不同質量濃度的混合對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣10 μL，以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2” 項下混合對照品溶液10 μL，在“2.1” 項色譜條件下連續進樣6 次，得沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素的峰面積RSD 分別為0.8%、1.0%、1.3%、1.9%、1.0%、0.8%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一份樣品粉末6 份，按“2.3” 項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素和木犀草素峰面積的RSD 分別為 1.0%、1.0%、1.255%、1.9%、1.0%、0.8%。表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣6 次，測得沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素的峰面積RSD 分別為0.7%、3.0%、1.8%、2.5%、2.4%、1.5%。表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取同一批藥材6 份，每份約1.5 g，精密稱定。分別精密加入混合對照品溶液。按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測定 取4 批九龍盤藥材粉末，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，每批平行3份。精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進行測定。計算九龍盤藥材中6 種成分的含有量，結果見表5。

表5 各成分含有量測定結果（n＝3，mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （n＝3，mg／g）

3 討論

實驗中分別考察了不同提取方式（超聲、回流）、不同濃度甲醇（80%、70%、60%） 和不同提取時間（60、90、120 min），最終確定以3 g 粉末中加入80%甲醇100 mL，回流提取2 h，色譜峰分離度和峰面積最佳，并作為供試品溶液的制備方法。在檢測波長的選擇上，分別對6 種成分進行全波長范圍掃描，最終確定0～20 min 為260 nm 檢測沒食子酸、原兒茶酸；20～55 nm 為360 nm 檢測異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素；55～60 min 為260 nm檢測木犀草素為檢測波長。對色譜系統（甲醇-水、乙腈-水）、酸水濃度（0.1%、0.2%、0.3%）、流動相的梯度，體積流量（0.6、0.8、1.0 mL／min）進行考察，最終確定以甲醇-0.2% 磷酸為流動相，體積流量0.8 mL／min 時色譜峰各個待測組分保留時間適中，分離度良好，峰形對稱。對不同色譜柱（COSMOSIL 5C18-PAQ、Ruby C18-B） 進行考察，結果顯示前者色譜柱分離效果好，且峰型對稱。

九龍盤現行的質量標準存在著質量控制指標單一、與藥效關聯性不強的問題，需要建立與安全性、有效性密切相關的質量控制方法和質量標準。酚酸類化合物在抗氧化、抗菌消炎、降血脂等方面具有很強的藥理作用［17］，黃酮類化合物的結構多樣性使其具有廣泛的藥理活性，如調血脂、擴張冠脈、止血、鎮咳、祛痰、降低血管脆性、抗菌、保肝、解毒、治療急慢性肝炎和肝硬化等作用［9］。本課題組前期研究發現九龍盤具有良好的鎮痛、抗炎作用，故本研究對前期提取分離得到的沒食子酸等酚酸類、黃酮類化合物作為含有量測定指標，符合中藥質量標志物（Q-marker） 的選擇條件［18-20］。對4 批九龍盤樣品進行含有量測定，含有量限度按照平均值下浮約80% 計算，建議沒食子酸、原兒茶酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素的含有量分別 不低于0.700 2、0.035 8、0.072 6、0.272 1、0.512 8、0.054 8 mg／g。本研究建立的方法操作簡單，精密度與重復性、穩定性好，專屬性強，以期為九龍盤質量控制的研究提供依據。