石斛甲醇提取物HPLC-MS 分析及4 種多酚測定

貢小輝，朱益靈，魏 淵，孔令東，韓邦興，歐陽 臻?

（1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江212013； 2.南京大學生命科學學院，江蘇 南京210093； 3.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安237012）

石斛屬是蘭科的一大屬，我國有74 個種和2個變種，其中有50 多種被作為藥用［1-2］。石斛藥用始載于秦漢時期《神農本草經》，被列為上品［3］。2015 年版《中國藥典》 收載有石斛與鐵皮石斛，石斛為蘭科植物金釵石斛Dendrobium nobileLindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxumLindl.或流蘇石斛Dendrobium fimbriatumHook.的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖，鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo 的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效［4］。現代藥理研究表明石斛具有保肝、調節免疫力［5］、抗白內障［6］和促進胃液釋放［7］等生物活性，其主要活性成分為黃酮、酚酸、多糖、生物堿等［8-10］。已有文獻報道黃酮和酚酸等多酚類成分在石斛的傳統藥效“厚腸胃，輕身延年” 方面具有顯著療效。Ekambaram G 等［11］對大鼠體內N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘導的胃癌研究表明，柚皮素對胃癌具有有效的保護和治療作用。刁紅星等［12］研究發現石斛酚與丁香酸協和具有抗白內障和肝保護的作用。黃丹丹等［13］對金釵石斛黃酮類成分活性研究表明，蘆丁具有抗氧化作用。

石斛來源眾多，分布較廣。現有文獻報道及課題組前期研究發現不同品種、不同產地石斛，其化學成分和藥理作用均有差異［14-17］。因此，本實驗采用HPLC-MS 法對石斛甲醇提取物的化學成分進行定性分析；建立HPLC 法同時測定石斛中丁香酸、氧化白藜蘆醇、蘆丁和柚皮素的含有量，并比較不同品種、產地石斛中多酚類成分的含有量差異，以期為其質量控制和臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 高效液相-線性離子阱質譜（FinniganTMLXQTM液質聯用儀，美國賽默飛世爾科技公司）；安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FA1204B 分析天平（上海精科-上海天平儀器廠）；BuchiR-200 型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 材料 對照品氧化白藜蘆醇（CAS29700-22-9，成都麥德生科技有限公司）；丁香酸（CAS530-57-4）、蘆丁（CAS153-18-4） （四川維克奮生物科技有限公司）；柚皮素（CAS480-41-1） （上海躍騰生物技術有限公司）。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。河南石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛和霍山石斛9 批樣品采自安徽省六安市霍山縣，其他10 批石斛分別采自江蘇、浙江、云南、江西等產地，由江蘇大學歐陽臻教授鑒定為正品。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 取樣品粉末1 g，精密稱定，加甲醇20 mL，70 ℃加熱回流提取1 次，提取時間2 h，濾過，濾液減壓蒸干，殘渣加甲醇使之溶解，并定容至5 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含丁香酸8.54 μg、氧化白藜蘆醇40.03 μg、蘆丁40.00 μg、柚皮素86.70 μg的混合對照品貯備液。精密吸取1 mL，逐級稀釋，得一系列不同質量濃度的對照品溶液，備用。

2.3 分析條件 SinoChrome ODS-AP 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） -0.2% 醋酸水（B），梯度洗脫（0～20 min，30%～45% A；20～30 min，45% A；30～40 min，45%～50% A；40～60 min，50%～55%A）；體積流量0.5 mL／min；檢測波長334 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

ESI 源負離子檢測；源電壓3.5 Kv；鞘氣（N2） 體積流量10.5 L／min；輔助氣（N2） 體積流量1.5 L／min；碰撞氣體為氦氣；毛細管溫度315 ℃；毛細管電壓-30 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m／z50～1 000。MS／MS 碰撞能量50%。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2” 中的對照品貯備液1 mL，逐級稀釋，制成系列不同質量濃度的6 份溶液。在“2.3” 項條件下進樣，以峰面積為縱坐標（Y），對照品濃度為橫坐標（X），進行回歸。結果見表2。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.3” 項條件下連續進樣6 次，每次10 μL，各對照品峰面積RSD 分別為1.69%、1.03%、1.82%、1.98%。表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取同一批次樣品6 份，按“2.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” 項條件下分別進樣10 μL，各峰面積RSD分別為1.19%、1.30%、1.68%、1.33%。表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在“2.3” 項條件下，分別于0、1、2、4、8、16、24 h各進樣10 μL，峰面積RSD 分別為0.85%、0.81%、1.36%、1.60%。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批藥材，共6 份，分別加入質量濃度分別為4.27、20.02、20.00、43.35 μg／mL 的丁香酸、氧化白藜蘆醇、蘆丁、柚皮素混合對照品溶液0.4、0.5、0.6 mL，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣，計算含有量。結果見表3。

2.6 甲醇提取物HPLC-MS 分析 采用HPLC-MS對石斛甲醇提取物中化學成分進行定性分析見圖1。根據各色譜峰的保留時間、紫外特征、分子離子峰及主要碎片峰信息結合相關文獻、SciFinder和化學專業數據庫等天然產物數據庫收錄的天然產物，可初步判斷確認10 個化合物的結構。其中化合物6 首次從石斛屬植物中得到。結果見表4。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

圖1 各樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of various samples

表4 提取物HPLC-MS 檢測結果Tab.4 Detection results of extracts by HPLC-MS

2.7 含有量測定

2.7.1 HPLC 色譜圖 在“2.3” 項條件下進樣，對照品及樣品色譜圖見圖2。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 樣品含有量測定 按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣，測定各樣品中各成分的含有量。結果見表5。

3 討論

3.1 定性分析 共鑒定出10 個化合物，其中氧化白藜蘆醇為首次在石斛屬植物中得到。有研究表明氧化白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤［22］、神經保護［23］等作用。

表5 各成分含有量測定結果（μg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （μg／g）

3.2 結果分析 霍山石斛和鐵皮石斛能同時測定出4 種多酚類成分，且霍山石斛多酚類含有量高于鐵皮石斛，霍山產鐵皮石斛高于其他產地鐵皮石斛。銅皮石斛中僅測定出丁香酸、氧化白藜蘆醇和柚皮素；河南石斛中測定出丁香酸、蘆丁和柚皮素；水草石斛中測定出丁香酸和柚皮素；紫皮石斛和金釵石斛中僅測定出丁香酸。不同品種石斛中多酚類成分含有量存在明顯差異。與文獻［24-26］報道不同石斛種屬間、不同產地的鐵皮石斛化學成分差異較大一致。課題組前期也發現霍山產鐵皮石斛小分子化合物含有量高，具有一定特殊性［17］。

3.3 色譜條件 據文獻［27-28］ 報道多酚類成分在240～280 和300～400 nm 2 個波長范圍內有吸收峰，本實驗考察了334、270 nm 2 個檢測波長，發現在334 nm 處各成分的色譜峰峰形良好，吸收較大；比較了甲醇-0.2% 醋酸和乙腈-0.2% 醋酸2 種流動相體系，發現前者作為流動相時，各成分色譜峰峰形良好，分離度較高；考察了柱溫25、30、35 ℃對分離效果的影響，發現25 ℃時，各成分的色譜峰峰形良好；考察了體積流量0.5、0.8、1.0 mL／min對分離效果的影響，表明0.5 mL／min時，各成分分離度較高。因此，本研究最終選擇“2.3” 項下色譜條件。

本研究建立HPLC 法同時測定石斛中丁香酸、氧化白藜蘆醇、蘆丁和柚皮素的含有量，該方法準確，簡便，重復性好，可用于石斛的質量控制。