HPLC-DAD 法同時測定四磨湯口服液中5 種多酚

楊雅蛟，孔維軍，孫 蘭，孫桂波，周立東

（中國醫學科學院藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京100193）

四磨湯最早記載于《重訂嚴氏濟生方》，由檳榔、枳殼、烏藥、木香組成，具有順氣降逆、消積止痛的功效，用于嬰幼兒乳食內滯證，中老年氣滯、食積證，以及腹部術后促進腸胃功能恢復［1-2］。

方中檳榔是棕櫚科植物檳榔Areca catechuL.的干燥成熟種子，為我國四大南藥之一［3］，李晨等［4］發現其有效成分可促進大鼠胃平滑肌收縮，它作為主要組成藥味在傳統使用過程中無毒性記載，但長期咀嚼時易引發口腔癌，對消化系統造成損傷，具有引發食道癌的風險［5］，2003 年被世界衛生組織的國際癌癥研究中心（IARC） 認定為一級致癌物［6］。檳榔主要有效成分是生物堿和多酚［7］，楊博等［8］發現高濃度檳榔堿有致口腔黏膜纖維化的作用，但少量入藥并不會引起該癥狀，另外其中還含有大量鞣質，主要包括兒茶素、焦性沒食子酸、表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等多酚類化合物［9-10］。Ranadive等［11］采用涂抹等方法使倉鼠頰囊長期暴露在檳榔多酚中，發現大塊不典型損害、癌前損害、癌瘤多種黏膜損害；還有學者認為，檳榔中含有大量多酚，在堿性條件下會產生一些致癌的含氧自由基，從而引發口腔癌［12］。

由于四磨湯中檳榔所含的多酚是其潛在毒性風險物質，故采用準確可靠的分析方法檢測該類成分含有量對探析其致癌原因和機理具有重要意義。本實驗建立了HPLC-DAD 法同時測定四磨湯口服液中5 種多酚的含有量，具有操作簡便、時間短、效率高等優勢，可為其質量控制提供技術支撐和數據支持。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色譜儀，配置PDA 996 檢測器（美國Waters 公司）；JM-30001 型電子天平（余姚紀銘稱重校驗設備有限公司）；N-1100型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；DLSB-5／20 型低溫冷卻循環儀（鄭州長城科工貿有限公司）；GP110-230 型無油隔膜泵（美國New Ipswich公司）。

檳榔液（批號161203）、四磨湯口服液（批號1801101666） 均由湖南漢森制藥股份有限公司提供。焦性沒食子酸（批號200401，純度99.2%）、表沒食子兒茶素（批號161122，純度99.7%）、兒茶素（批號201604，純度99.8%）、表兒茶素（批號200102，純度99.4%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號161201，純度99.8%） 對照品均由北京中科質檢生物技術有限公司提供。

乙腈為色譜純 （美國 Fisher 公司，批號106246）；乙酸為色譜純（天津市光復科技發展有限公司，批號12NK4021-2013）；石油醚為分析純（北京市通廣精細化工公司，批號20180717，60～90 ℃）；乙酸乙酯為分析純（北京市通廣精細化工公司，批號20190613）；水為娃哈哈純凈水（批號201807011117GQ）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 XSelect HSS T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） -2% 乙酸（B），梯度洗脫 （0～15 min，5%～10% A；15～23 min，10%～5%A；23～25 min，5%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。

2.2 供試品溶液制備 精密量取10 mL 口服液至分液漏斗中，10 mL 石油醚（沸程60～90 ℃） 萃取3 次，棄去石油醚萃取層，再用10 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯萃取層，濃縮至干，乙腈-2% 乙酸（50 ∶50） 定容于5 mL 量瓶中，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，待用。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品焦性沒食子酸10.0 mg、表沒食子兒茶素15.0 mg、兒茶素25.0 mg、表兒茶素20.0 mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯15.0 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL 于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（含158.72 μg／mL 焦性沒食子酸、239.28 μg／mL 表沒食子兒茶素、399.20 μg／mL 兒茶素、318.08 μg／mL 表兒茶素、239.52 μg／mL 表沒食子兒茶素沒食子酸酯）。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 取對照品、供試品（口服液、檳榔湯） 溶液適量，在“2.1” 項下色譜條件進樣測定，結果見圖1。由此可知，各多酚分離效果良好，峰形理想，滿足檢測需求。

2.4.2 線性關系考察 精密量取0.1、0.5、0.8、1.2、1.5、2.0 mL 對照品溶液至2 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成6 個質量濃度的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表1，可知各多酚在各自范圍內線性關系良好。

2.4.3 精密度試驗 取“2.3” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得焦性沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯含有量RSD 分別為0.5%、0.3%、0.6%、0.4%、0.5%，保留時間RSD 分別為1.0%、0.5%、1.0%、0.6%、0.9%，表明儀器精密度良好。

圖1 各多酚HPLC-DAD 色譜圖Fig.1 HPLC-DAD chromatograms of various polyphenols

2.4.4 重復性試驗 按“2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得焦性沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯含有量RSD 分別為1.2%、0.8%、0.9%、1.0%、0.8%，保留時間 RSD 分別為 1.0%、0.9%、1.0%、0.8%、0.8%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下于0、4、8、12、16、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得焦性沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯含有量 RSD 分別為 0.8%、1.0%、0.9%、0.9%、1.0%，保留時 間 RSD 分別為 0.5%、0.8%、0.5%、1.0%、1.2%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密吸取9 份各多酚含有量已知的口服液，每份10 mL，置于分液漏斗中，每3 份為1 組，按80%、100%、120%水平加入對照品溶液，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見表2。

表1 各多酚線性關系Tab.1 Linear relationships of various polyphenols

2.4.7 樣品含有量測定 取四磨湯口服液、檳榔液各6 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件篩選

3.1.1 色譜柱 本實驗考察了 Tnatue C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）、XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱對5 種多酚的分離效果和峰形，發現后者更理想，故選擇其作為色譜柱。

3.1.2 流動相 本實驗考察了不同流動相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2% 乙酸、乙腈-2% 乙酸），發現以甲醇-水洗脫時，色譜峰分離時間長，拖尾嚴重；以乙腈-水洗脫時，色譜峰分離時間比甲醇-水短，但拖尾依然嚴重；以甲醇-2%乙酸洗脫時，色譜峰沒有出現拖尾現象，但分離時間長；以乙腈-2%乙酸洗脫時，色譜峰沒有出現拖尾現象，分離時間也短，故選擇其作為流動相。然后，考察了等度洗脫 （20 ∶80，流動相1）、梯度洗脫 （0～18 min，5%～20%乙腈；18～23 min，20%～5%乙腈；23～25 min，5% 乙腈，流動相2）、梯度洗脫（0～15 min，5%～10% 乙腈；15～23 min，10%～5%乙腈；23～25 min，5% 乙腈，流動相3） 的分離效果，發現以流動相1 洗脫時，分離時間長，色譜峰不能較好分離；以流動相2 洗脫時，5 種多酚完全分離，表兒茶素與其前1 個色譜峰未得到完全分離，需降低乙腈比例；以流動相3 洗脫時，表兒茶素與其前1 個色譜峰完全分離，故選擇其作為流動相。

表2 各多酚加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various polyphenols （n＝9）

表3 各多酚含有量測定結果（mg／mL， n＝6）Tab.3 Results of content determination of various polyphenols （mg／mL， n＝6）

3.2 樣品前處理方法篩選 本實驗考察了“直接進樣” （方法1）、“石油醚萃取，蒸干石油醚萃取層，流動相溶解進樣” （方法2）、“乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯萃取層，流動相溶解進樣” （方法3）、“先石油醚萃取，棄去石油醚萃取層，再用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯萃取層，流動相溶解進樣” （方法4），發現方法4 能較好地排除樣品雜質干擾，從而實現靈敏檢測。

3.3 含有量分析 在檳榔安全性評價中，研究最多的是生物堿，而多酚未有明確的安全性評價報道。本實驗發現，四磨湯口服液中主要多酚含有量低于檳榔液中，并且不含兒茶素，有望降低其致癌性，其原因可能為在制備過程中檳榔與其他藥材配伍后發生反應，從而降低部分多酚含有量。

4 結論

目前，關于檳榔多酚的報道較少，對四磨湯口服液的研究也主要集中于檳榔堿、新弗林、去甲異爾定、柚皮苷、橙皮苷等成分，鮮有涉及其他成分定量測定，為了保證該制劑用藥安全性，需全面考慮其中多種成分的性質、含有量變化等。本實驗采用HPLC-DAD 法，能實現四磨湯口服液中5 種多酚含有量的同時測定，而且線性范圍寬，分析速度快，精密度、穩定性好，可為檳榔及其復方的相關研究提供參考。