HPLC 法同時測定華佗救心丸中8 種蟾蜍二烯內酯

周文莉，祝宇龍，李龍飛，趙 冰，彭 燦?，闞家義

（1.安徽中醫藥大學藥學院，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012； 2.華佗國藥股份有限公司，安徽 亳州236800； 3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051）

蟾酥是蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺體的分泌物，白色乳狀液體或淺黃色漿液［1］，是我國常用的一味傳統名貴中藥，主要含有蟾蜍二烯羥酸內酯類［2-3］、蟾毒色胺類、甾醇類等成分，以蟾酥二烯內酯類為主?，F代藥理學研究表明［4-7］，蟾酥有增強心肌收縮力、麻醉、降壓、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抑制血小板聚集、增加冠狀動脈血流等藥理活性，但其毒性也大，用藥不當會出現嚴重不良反應［8-10］，故對其服用劑量有嚴格要求。

華佗救心丸由蟾酥、人參莖葉總皂苷、牛膽膏粉、人工麝香、珍珠、人工牛黃、冰片、三七膏粉組成［11-13］，其執行標準收載于《衛生部藥品標準.中藥成方制劑》 第十九冊（標準文號WS3-B-3675-98），但目前大多以單一或幾種成分含有量為指標來表征其質量［14-16］，存在操作繁瑣、時間長、檢測不全面、成本高等缺點，故有必要研究開發一種簡便快捷、全面準確的含量測定方法。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量，以期對該制劑質量進行有效控制。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2489 高效液相系統 （美國Waters 公司）；YL-060S 超聲波清洗器（深圳市語路清洗設備有限公司，360 W，40 kHz）；電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 酯蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠華蟾毒精、華蟾毒它靈對照品（純度≥98%），均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。華佗救心丸（批號201901、201902、201903、201904、201905），由華佗國藥股份有限公司提供。乙腈購于西格瑪奧德里奇（上海） 貿易有限公司；甲醇購于北京百靈威科技有限公司；乙醇購于上海潤捷化學試劑有限公司；水為超純水 （美國Pall 公司純水機制備）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Thermo Scientific C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（A） -乙腈（B），梯度洗脫 （0～2 min，20%～38% B；2～5 min，38%～56% B；5～19 min，56%～66% B；19～19.1 min，66%～20% B；19.1～20 min，20%B）；體積流量0.6 mL／min；檢測波長296 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取遠華蟾毒精、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈對照品適量，甲醇制成1 mg／mL 貯備液，吸取適量，甲醇稀釋，即得（0.1 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取5 批丸劑，研細，每批取約0.3 g，精密稱定，精密加入20 mL 甲醇，室溫下超聲處理20 min 后取出，冷卻，甲醇補足減失的質量，振蕩搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 精密量取“2.2” 項下對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與其前后峰的分離度均大于1.5，理論塔板數以蟾毒靈峰計為3 000，其他成分對測定無干擾。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下貯備液適量于量瓶中，甲醇稀釋至刻度，振蕩搖勻，制成質量濃度為5、10、25、50、100 μg／mL的系列溶液，精密吸取適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.41%、0.43%、0.42%、0.43%、0.41%、0.44%、0.52%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液（批號201901） 適 量，于2、4、6、12、24、48 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.54%、0.52%、0.45%、0.58%、0.46%、0.60%、0.65%、0.61%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constitutents

2.3.5 重復性試驗 取丸劑（批號201901） 適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為 2.35%、3.47%、3.59%、2.84%、1.46%、1.67%、0.27%、0.49%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取丸劑（批號201901） 適量，共6 份，加入“2.2.1” 項下貯備液適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均加樣回收率分別 為 98.54%、95.07%、97.45%、99.58%、100.46%、102.59%、98.65%、97.61%，RSD 分別為2.75%、2.46%、1.53%、2.81%、1.42%、1.60%、2.03%、2.19%。

2.3.7 樣品含有量測定 取5 批丸劑，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取時間篩選 本實驗考察了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、提取時間（10、20、40、60 min） 對提取效果的影響，發現以甲醇為提取溶劑超聲提取20 min 時，蟾蜍二烯內酯類成分提取效率最高。

表2 各成分含有量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3.2 色譜條件篩選 本實驗考察了Unitary C18、Thermo Scientific C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） 的分離效果，發現后者更理想。然后，考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃），發現30 ℃時分離效果最佳。

3.3 流動相篩選 本實驗考察了0.15% 磷酸-乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、水-乙腈的分離效果，發現以水-乙腈為流動相時色譜峰峰形較好，并且為非酸性溶液，對儀器損害較小，并按“2.1” 項下比例梯度洗脫，此時各成分色譜峰分離度均大于1.5，而且峰形完整。

4 結論

本實驗所采用的HPLC 法具有簡便、快速、穩定、精密度和重復性良好的優點，能在同一色譜條件下同時測定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量，不僅能有效鑒別該制劑中蟾酥微量成分的有無，也可對其含有量進行全面準確的檢測，以期為相關質量控制提供重要保障［17-19］。