紅曲菌在釀酒過(guò)程中的生產(chǎn)應(yīng)用試驗(yàn)研究

李富強(qiáng)，閆培勛，曹振華，李紹亮，李學(xué)思，郭淑平，張祥德

（河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑 477265）

紅曲菌是一種腐生真菌，具有典型霉菌的特征，喜暖喜濕，能形成分枝甚繁的菌絲體，呈肉眼可見(jiàn)的絨絮狀，呈紅色、褐色或無(wú)色，紅曲菌生活能力較強(qiáng)，在pH3～5 范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，能耐受10%vol 乙醇，能在含25%甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，能利用葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘油、山梨醇、乳酸等[1]。但其在分類學(xué)上又不屬于霉菌，紅曲菌在分類學(xué)上屬于真菌界、子囊菌門、真子囊菌綱、散囊菌目、紅菌科[2-3]。目前中科院微生物菌種保藏管理委員會(huì)正式收藏保存的紅曲菌有8 種共48 個(gè)菌株，常見(jiàn)紅曲菌種類有紅曲紅曲菌(M.anka)、紅色紅曲菌(M.ruber)、紫色紅曲菌(M.purpureus)、煙色紅曲菌(M.fuliginosus)、佛羅里達(dá)紅曲菌（M.floridanus）、血紅色紅曲菌（M.sanguineus）、叢毛紅曲菌（M.pilos)、橙色紅曲菌（M.aurantiacus)、血紅紅曲菌（M.sanguineus）和蒼白紅曲菌（M.pallens）等[4-5]。

紅曲菌廣泛分布于自然界中，能產(chǎn)生多種酶：淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、α-葡萄糖苷酶、酯化酶等。紅曲菌能產(chǎn)生紅黃兩系色素如紅曲玉紅胺、紅曲玉紅素、紅曲素、N-葡糖基紅斑胺、N-葡糖基紅曲紅胺、N-戊二酰基紅斑胺等。紅曲菌代謝產(chǎn)物也有桔霉素、莫納可林K、γ-氨基丁酸（GABA）等。

宋河酒業(yè)采用老五甑工藝，續(xù)米查配料，在不同米查次之間所產(chǎn)原酒質(zhì)量均有所不同。本實(shí)驗(yàn)以宋河中高溫大曲為實(shí)驗(yàn)材料篩選出1 株紅曲菌，以該株紅曲菌為研究對(duì)象生產(chǎn)酯化紅曲，在宋河酒業(yè)釀酒生產(chǎn)車間不同米查次添加不同質(zhì)量的酯化紅曲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為以后紅曲菌的生產(chǎn)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)原輔料：中高溫大曲，來(lái)自宋河酒業(yè)制曲車間；麩皮，市售優(yōu)質(zhì)麩皮。

試劑及耗材：氫氧化鈉，乳酸，鹽酸，酚酞，己酸，無(wú)水乙醇，葡萄糖，硫酸銅，10 g/L 次甲基藍(lán)溶液，pH4.6緩沖溶液，2.5 mol/L硫酸溶液，凡士林，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，麥芽浸粉，酵母膏等。

儀器設(shè)備：可見(jiàn)分光光度計(jì)（721 型，上海悅豐儀器儀表有限公司）；氣相色譜分析儀（GC102AT氣相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）；電子天平（MD200-3 型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；真空抽濾裝置；電熱恒溫水浴鍋（HH-6型，金壇市金南儀器制造有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，天津華鑫儀器廠)；電子萬(wàn)用爐（DL-100 型，天津市泰斯特儀器有限公司）；搖床；試管；燒杯；玻璃棒等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酯化紅曲制作流程

試驗(yàn)采用以下流程進(jìn)行：純種紅曲菌→活化→種子培養(yǎng)基→擴(kuò)大培養(yǎng)→接種→盒子曲→酯化紅曲。

1.2.2 檢測(cè)方法

酯化紅曲檢測(cè)方法：水分采用電熱烘干法[6]，糖化力采用斐林試劑法[7]，酯化力采用皂化法[8]。

糟醅檢測(cè)方法：水分采用電熱烘干法[6]，淀粉采用斐林試劑滴定法[7]，酸度采用酸堿中和法[7]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方案

方案1：1#池、2#池和3#池添加紅曲量為投糧量5%，減少中高溫曲量為投糧量的2.5%。

方案2：實(shí)驗(yàn)4#、實(shí)驗(yàn)5#和實(shí)驗(yàn)6#添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%。

方案3：實(shí)驗(yàn)7#、實(shí)驗(yàn)8#和實(shí)驗(yàn)9#添加紅曲量為投糧量2.75%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌篩選分離結(jié)果

以宋河中高溫大曲為實(shí)驗(yàn)材料篩選紅曲菌，將中高溫大曲曲心處有粉紅色或紅色菌落的部位分別粉碎，加入一定量的無(wú)菌水，于150 r/min，30 ℃搖床上培養(yǎng)1 h 即成菌懸液，靜置1 h 后吸取1 mL上清液加入到9 mL 無(wú)菌水試管中，然后依次用無(wú)菌水稀釋至10-2～10-7，共7 個(gè)梯度，涂布在改良麥芽汁培養(yǎng)基平板上[9-10]。30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取具有紅曲菌基本形態(tài)特征的菌落，轉(zhuǎn)接到改良麥芽汁培養(yǎng)基斜面，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，采用繼代分離純化法進(jìn)行純化培養(yǎng)[11]。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)純化培養(yǎng)后，將所得到的純菌種接種到用麥芽汁培養(yǎng)基制作的斜面進(jìn)行保藏。經(jīng)過(guò)多次篩選純化得到1株紅曲菌，保存于宋河酒業(yè)科研中心菌種保藏室。

2.2 酯化紅曲酯化力測(cè)定結(jié)果

篩選出的紅曲菌經(jīng)過(guò)純化后應(yīng)用于生產(chǎn)酯化紅曲。采用熟料麩皮培養(yǎng)酯化紅曲，生產(chǎn)出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊的酯香，檢測(cè)分析酯化紅曲酯化力與中高溫大曲酯化力的不同，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 酯化紅曲與中高溫大曲酯化力結(jié)果

由表1 可知，酯化紅曲酯化力水分含量略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酸度也略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酯化力明顯高于中高溫大曲的酯化力，是中高溫大曲的3倍以上。

2.3 紅曲生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 實(shí)驗(yàn)前后糟醅理化指標(biāo)

通過(guò)在酒糟中添加一定量的酯化紅曲并且相應(yīng)地減少一定量的中高溫大曲進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)方案，即方案1、方案2 和方案3，3 個(gè)試驗(yàn)方案所添加酯化紅曲的量均不同，每個(gè)方案選擇3 條窖池進(jìn)行試驗(yàn)。酯化紅曲除具有較強(qiáng)的酯化能力之外還能產(chǎn)生淀粉水解酶和蛋白酶，分解淀粉和蛋白質(zhì)等，影響糟醅殘余淀粉含量，酸度及水分含量。糟醅中的水分不僅是微生物生化反應(yīng)所必需的介質(zhì)、生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)的必要條件，而且在產(chǎn)高質(zhì)量酒中起著重要作用[12]。糟醅中的酸可以提供有益微生物的營(yíng)養(yǎng)和生成酒體中各種風(fēng)味物質(zhì)并促進(jìn)酯的生成[13]，試驗(yàn)前后不同方案中酒糟理化分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 可知，方案1 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了18.41%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了2.81 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了54.84%；方案2 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.72%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.95 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了48.04%；方案3 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.69%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.82 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了41.18%。產(chǎn)酒過(guò)程中主要是把淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解成乙醇和水及一些呈香呈味物質(zhì)，糟醅淀粉下降速度越快，糟醅水分增加越多，產(chǎn)酒能力也越強(qiáng)。方案1 的淀粉下降速度最快、糟醅水分增加也最多，說(shuō)明同等條件下方案1 產(chǎn)酒較多，這也間接說(shuō)明酯化紅曲有增加出酒率的能力。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)窖池酒樣色譜結(jié)果及產(chǎn)量結(jié)果

由表3可知，方案1平均產(chǎn)量為339.81 kg，出酒率42.48%；方案1 所產(chǎn)原酒優(yōu)級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為3.1734 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了35.39%，四大酯總含量提高了33.11%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了34.72%；方案1 所產(chǎn)原酒三級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為1.6793 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了18.75%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了35.07%。

由表4可知，方案2平均產(chǎn)量為323.83 kg，出酒率40.48%；方案2 所產(chǎn)原酒優(yōu)級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為3.1455 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了34.20%，四大酯總含量提高了16.41%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了41.52%；方案2 所產(chǎn)原酒三級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為1.6546 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了17%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了49.22%。

表2 實(shí)驗(yàn)前后糟醅理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

表3 方案1酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

表4 方案2酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

表5 方案3酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

由表5可知，方案3平均產(chǎn)量為300.38 kg，出酒率37.55%；方案3 所產(chǎn)原酒優(yōu)級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為3.0460 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了29.95%，四大酯總含量提高了18.85%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了37.05%；方案3 所產(chǎn)原酒三級(jí)酒中己酸乙酯含量平均為1.6530 g/L，相比于對(duì)照窖池己酸乙酯高了16.89%，相比于對(duì)照窖池乳酸乙酯降低了45.80%。

表6 混合酒樣色譜分析結(jié)果 (g/L)

2.3.3 感官嘗評(píng)結(jié)果

對(duì)所產(chǎn)基酒進(jìn)行感官嘗評(píng)[14]，由3 位國(guó)家級(jí)品酒師和5 位省級(jí)品酒師分別對(duì)白酒的色澤、香氣、口味、風(fēng)格進(jìn)行品評(píng)，并且根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行共同品評(píng)打分。其感官嘗評(píng)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 混合酒樣感官嘗評(píng)結(jié)果

由表6 與表7 可知，在釀酒生產(chǎn)過(guò)程中添加一定量紅曲，所產(chǎn)原酒中己酸乙酯含量明顯增加，乳酸乙酯含量明顯降低；在釀酒生產(chǎn)過(guò)程中添加一定量紅曲，其感官嘗評(píng)結(jié)果相對(duì)較好，復(fù)合香氣相比對(duì)照樣較好，綿柔度優(yōu)于對(duì)照樣；紅曲混合樣優(yōu)級(jí)相比于對(duì)照樣優(yōu)級(jí)己酸乙酯含量增加了32.47%，紅曲混合樣三級(jí)相比于對(duì)照樣三級(jí)己酸乙酯含量增加了15.91%；紅曲混合樣優(yōu)級(jí)相比于對(duì)照樣優(yōu)級(jí)乳酸乙酯含量降低了36.42%，紅曲混合樣三級(jí)相比于對(duì)照樣三級(jí)己酸乙酯增加了35.62%。

隨著紅曲添加量的增加，所產(chǎn)原酒中己酸乙酯含量也隨之增加，方案1與方案2 之間的差距較小，但均優(yōu)于方案3。綜合以上因素并結(jié)合綜合成本與效益初步認(rèn)定方案2 較好，即釀酒生產(chǎn)過(guò)程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時(shí)原酒產(chǎn)質(zhì)量較好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以宋河中高溫大曲為實(shí)驗(yàn)材料，選取曲心處呈紅色或粉紅色部位，通過(guò)富集，初篩復(fù)篩，并根據(jù)紅曲菌菌落形態(tài)特征及顯微鏡觀察初步確定1株紅曲菌。以熟料麩皮為小試培養(yǎng)基生產(chǎn)酯化紅曲，生產(chǎn)出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊酯香，且其酯化力是普通中高溫大曲酯化力的3倍以上。

通過(guò)在釀酒生產(chǎn)過(guò)程添加不同比例的酯化紅曲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，添加酯化紅曲的實(shí)驗(yàn)窖池其原酒己酸乙酯和總酯含量明顯增加，原酒感官嘗評(píng)結(jié)果明顯較好，添加酯化紅曲的窖池所產(chǎn)原酒窖香濃郁，復(fù)合香氣好，綿柔度好，后味凈，風(fēng)格突出。3 種添加方案對(duì)比可知，方案1 和方案2 增加較為明顯，綜合以上因素并結(jié)合綜合成本與效益，初步認(rèn)定方案2 較好，即釀酒生產(chǎn)過(guò)程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時(shí)，原酒產(chǎn)質(zhì)量較好。

本實(shí)驗(yàn)為生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)，濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程屬于開放性過(guò)程，可能會(huì)受到許多外界自然因素和人為因素的干擾。在以后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)盡量避免外界因素的干擾及增加平行試驗(yàn)的次數(shù)，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。