功能菌液對窖泥轉化的影響研究

劉多濤 ，羅青春，喬宗偉，2，李 智，施 思，雷學俊，張 霞，鄭 佳

（1.宜賓五糧液股份有限公司,四川宜賓 644007；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644007）

中國白酒因其獨特的口感與香氣被譽為世界六大蒸餾酒之一，濃香型白酒作為傳統白酒四大香型之一，占有舉足輕重的地位[1]。從濃香型白酒的生產環節來看，釀酒微生物來源十分廣泛，包括大曲、窖泥、車間空氣、生產器械、生產用水及物料混配的場地等，其中大曲和窖泥是濃香型白酒釀造微生物的主要來源。

在我國傳統濃香型白酒釀造過程中，窖池是基礎，是多種微生物生長和繁殖的載體，是我國濃香型白酒生產的關鍵設備。在長期的固態發酵、續糟工藝操作以及窖池周期閉合的影響下，窖池微生態環境不斷發生菌群演替，形成復雜的微生物多樣性。正是由于這些有益功能菌的大量生長、繁殖、代謝以及相互協調作用，才賦予了白酒的獨特香型，造就了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風格[2]。窖池微生物群落結構決定著窖池的質量，而窖池質量左右著傳統白酒生產質量和風格的穩定性。

本試驗在傳統人工窖泥培養的基礎上，通過以黃水為主要原料的培養基，培養協調而全面的老窖泥功能微生物菌群并應用于小窖池發酵過程。以期為窖池的轉化提供重要依據，從而為濃香型白酒質量及產量的提升研究打好理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖池：車間正常生產窖池；黃水：車間生產用窖池黃水。

培養基：稀釋10 倍黃水中，添加0.5%酵母膏、0.1%葡萄糖、6%酒樣（按純酒精計），1 mol/L 氫氧化鈉調pH值調至5.0。

耗材：細菌宏基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工）；古菌宏基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工）；細 菌：341F 引 物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCC TACGGGNGGCWGCAG；805R 引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC；古菌：349F 引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNGYGCASCAGKCGMGAAW；806R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGG -TATCTAAT。

1.2 實驗方法

1.2.1 功能菌液培養

在1.1 培養基中接入老熟窖泥，接種量為10%，35 ℃靜置培養5 d。

1.2.2 有機酸檢測

對培養好的功能菌液的有機酸進行檢測，運用衍生化法進行檢測，具體檢測方法見曹云剛[3]等。

1.2.3 微生物群落結構分析

1.2.3.1 基因組DNA提取

采用差速離心法收集微生物細胞沉淀[4]，采取反復凍融與試劑盒相結合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應加入的DNA量。按照產品說明書進行操作。

1.2.3.2 PCR擴增

利用引物341F 和805R 對菌液細菌基因組16S rDNA V3—V4 進行擴增，利用引物349F 和806R 對菌液古菌基因組16S rDNA V3—V4 進行擴增。擴增體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L each）0.5 μ L，DNA 10 ng，引 物F（50 μmol/L）0.5 μL，引物R（50 μmol/L）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL。擴增程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，45 ℃20 s，65 ℃30 s，共5 個循環；94 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s，共20 個循環；72 ℃5 min。

1.2.3.3 DNA純化及高通量測序

DNA 純化及高通量測序由上海生工有限公司完成。利用Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒對回收的DNA 精確定量，以方便按照1∶1 的等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA 量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。高通量測序數據主要采用Mothur 和Excel 軟件進行統計和分析，將相關序列提交NCBI數據庫進行BLAST同源性比較。

1.2.4 試驗新窖池應用

用噴壺把培養好的功能菌液均勻噴灑在試驗的小窖池，噴灑位置為窖池底部和壁下層。

2 結果與分析

2.1 有機酸分析（表1）

表1 發酵液有機酸含量分析 (mg/100 mL)

將培養好的功能菌液進行有機酸檢測，結果見表1。由表1 可看出，空白樣中己酸與乳酸含量分別為6.13 mg/100 mL 和373.4 mg/100 mL，發酵液己酸與乳酸含量分別為389.2 mg/100 mL 和20.73 mg/100 mL，該培養液能產生大量的己酸，并有顯著降解乳酸的作用。而己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯被稱為四大酯類。其中，己酸乙酯是濃香型白酒的主體香，其重要前體物質就是己酸，它在白酒中具有重要的呈味作用。

2.2 功能菌液微生物群落結構分析

2.2.1 測序序列數目和多樣性指數分析

為進一步清楚地了解菌液的微生物群落結構，對菌液細菌和古菌的16S rDNA V3—V4 區進行高通量測序分析，結果表明，Coverage 指數即取樣覆蓋率均超過97%，樣品稀釋曲線見圖1。從圖1 可知，樣品隨著測序序列數的增加，當reads 數超過5000 后，多樣性指數曲線趨于平坦，說明本次試驗取樣合理，結果能代表樣本的真實情況。

圖1 樣品稀釋曲線

2.2.2 功能菌液細菌多樣性分析

對樣品中微生物多樣性進行分類分析，可以知道樣品中含有何種微生物及各微生物的相對豐度。為了展示效果，一般只顯示相對豐度前50 的微生物分類，剩余合并為other。

圖2 功能菌液細菌群落結構

如圖2 所示，發酵液細菌群落中，梭菌屬（Clostridium）為絕對優勢菌群，占比為51.36%，而梭狀芽孢菌屬（Clostridium sensu stricto）和Garciella的比例分別為21.73%和8.48%。在窖泥微生物群落中，厭氧梭菌一直被認為是白酒風味物質形成的重要微生物，如Clostridium kluyveri、產丁酸梭菌（C.butyricum）和酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）等，能產生特征香氣物質己酸乙酯、丁酸乙酯的前體物質己酸、丁酸等[6]。劉博等[7]研究表明，濃香型白酒中主要窖泥臭味物質4-甲基苯酚的主要微生物來源是梭菌屬。

2.2.3 功能菌液古菌多樣性分析

如圖3 所示，發酵液古菌群落中，甲烷囊菌屬(Methanoculleus)為絕對的優勢菌，占比為76.01%，而熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas）和甲烷桿菌屬（Methanobacterium）的比例則依次為16.43%和6.8%。

圖3 功能菌液古菌群落結構

2.3 試驗小窖池窖泥變化

對比了小窖池窖底泥試驗前后的顏色，水分和pH 值差異，結果見表2。功能菌液應用于小窖池后，窖底泥從黃色變為了灰色，水分均有增加，pH值均有所升高，越接近于中性。說明能較好的改變小窖池的窖底泥。

3 討論

本研究以黃水為主要原料設計了創新的培養基，用以富集老窖泥功能菌群，此菌液具有產生高濃度己酸的作用，并且在噴淋至窖泥后一定程度上促進了窖泥感官特征和pH 值的轉化，這可能與其中含有大量的厭氧梭菌和甲烷菌群有關，金城[8]研究表明，梭菌對于瀘型酒中己酸乙酯等典型風味物質的形成具有重要作用。薛正楷等[9]篩選出了1 株具有高效產己酸特性的梭菌，栗連會[10]從窖泥中分離到了降解乳酸的梭菌屬等菌株。發酵液中的優勢菌群甲烷囊菌屬(Methanoculleus)是四川地區濃香型白酒窖泥的主要功能甲烷菌之一[11]，屬氫營養性甲烷菌，能夠利用氫氣和甲酸作為底物產生甲烷，常與梭菌屬細菌共生生成乙酸，丙酸等。甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）能夠利用乙酸產生己酸。另外，研究表明，甲烷囊菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷八疊球菌屬在10 年以上窖泥中豐度較高，尤其是甲烷八疊球菌屬在25 年以上老窖泥中豐度會進一步提高[12]，說明其在老窖泥中的重要作用。

表2 試驗小窖池窖底泥物理特性變化

由于濃香型白酒窖泥質量隨窖齡延長在不斷地變化，不同方式培養的窖泥變化速度有差異；同時不同季節和不同入窖條件對產酒質量也有一定的影響。因此該試驗只是在功能菌液對窖泥老熟轉化方面進行初步探索，進一步探索功能菌液對窖泥的長期影響將是重要的課題。