畢赤酵母發(fā)酵過程的染菌分析及預防策略

曹家明 許超群 曾憲放

摘要：針對畢赤酵母（Pichia pastoris）在發(fā)酵過程中發(fā)生的染菌現象，按照質量控制要素及工藝流程進行全面分析。通過對工作種子庫、一級種子、二級種子、濾芯、發(fā)酵罐及發(fā)酵菌體進行系統(tǒng)排查發(fā)現，染菌是由賽多利斯取樣閥密封圈磨損及試驗人員的不規(guī)范操作造成的。因而在試驗操作、設備維護、車間管理、文件修訂、人員培訓等方面實施一系列糾正預防措施，隨后進行多批次的發(fā)酵生產。結果表明，試驗結果與歷史數據具有高度的一致性，從而避免了染菌現象的再次發(fā)生。

關鍵詞：畢赤酵母;發(fā)酵;染菌分析;預防策略

中圖分類號： S182?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0265-07

收稿日期：2019-03-18

基金項目：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（編號：2015ZX09101035、2017ZX09308003）;上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥領域科技支撐項目（編號：18431905600）;上海市科技人才計劃（編號：16QB1404200）。

作者簡介：曹家明（1985—），男，江蘇常州人，碩士，工程師，主要從事生物藥物開發(fā)、基因工程菌發(fā)酵、蛋白藥物純化等方面的研究。E-mail：caojiaming@walvax.com。

自從Cregg等于1985年利用重組畢赤酵母（Pichia pastoris）成功表達外源蛋白[1]以來，畢赤酵母因高效表達外源蛋白、操作簡單、易于培養(yǎng)、生產成本低廉等優(yōu)點而受到科學家和工業(yè)界的青睞，目前已有超過500個蛋白在畢赤酵母中表達成功，表達產物包括干擾素、酶制劑、抗體等[2-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，簡稱FDA）認定畢赤酵母是一般公認安全的（generally regarded as safe，簡稱GRAS）微生物，為其在醫(yī)藥和食品中的應用鋪平了道路[5]。目前，人們已經在該系統(tǒng)中成功表達了胰島素、彈性蛋白酶、S-腺苷基甲硫氨酸、干擾素、白細胞介素、溶菌酶等多種治療性藥物[6-7]。隨著畢赤酵母表達系統(tǒng)研究的不斷推進，會有更多外源蛋白在畢赤酵母中表達，從而在醫(yī)學、微生物學等相關領域發(fā)揮重要作用。

隨著發(fā)酵技術、生物反應器設計制造的發(fā)展更新，生產過程中的染菌率已經明顯下降，然而染菌仍是發(fā)酵產業(yè)的最大“敵人”，染菌輕者會降低產品的產率及質量，嚴重者會造成發(fā)酵失敗，不僅會增加發(fā)酵的生產成本，打亂生產計劃，還會造成環(huán)境污染[8-9]。宋磊等從染菌時間、類型、范圍3個方面探討透明質酸發(fā)酵染菌的原因，提出防止發(fā)酵染菌及染菌后的補救措施[10]。任石茍等對乳酸生產過程中的染菌原因進行分析，提出了預防和治理措施[11]。李素榮等通過加強菌種、無菌用具、環(huán)境、人員培訓等的管理，使染菌率由9.64%降至1.20%[12]。丁瑋云等介紹了賴氨酸發(fā)酵染菌的危害性及由設備引起的染菌原因，并提出防控措施[13]。劉利通過現場跟蹤調查，得出設備、空氣和員工操作失誤引起的染菌概率最大，應該從這3個方面入手減少染菌[14]。目前的染菌研究多集中于抗生素、谷氨酸等傳統(tǒng)產品在發(fā)酵過程中的染菌途徑、不同發(fā)酵階段染菌對發(fā)酵的影響及防治措施等方面[9，15-16]，鮮有針對藥品生產質量管理規(guī)范（good manufacturing practices，簡稱GMP）環(huán)境下發(fā)酵生產中染菌排查的報道[17]。本研究以筆者所在公司車間在進行畢赤酵母發(fā)酵表達外源蛋白的生產過程中發(fā)現的1例染菌現象為列，對可能的染菌過程進行分析、排查，并采取相應的預防和整改措施，以期為醫(yī)藥企業(yè)在重組菌發(fā)酵生產中出現染菌現象時進行快速排查及預防提供一些思路。

1?材料與方法

1.1?試驗試劑

酵母粉，購自OXOID公司;蛋白胨，購自日本制藥株式會社;甘油，購自湖南爾康制藥股份有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 （tryptone soy agar，簡稱TSA培養(yǎng)基）平板，購自上海源培生物科技股份有限公司。

1.2?酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，簡稱YPG培養(yǎng)基）

YPG培養(yǎng)基配方如下：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、20 g/L甘油。用2 L錐形瓶分裝1 L培養(yǎng)基，在30 L發(fā)酵罐中裝入8 L培養(yǎng)基，在210 L發(fā)酵罐中裝入120 L培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌20 min。

1.3?儀器與設備

NLF22 30 L發(fā)酵罐，購自瑞士比歐生物工程公司;BIOSTATC-plus 30 L發(fā)酵罐，購自賽多利斯公司;P 210 L發(fā)酵罐，購自瑞士比歐生物工程公司;立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博迅實業(yè)有限公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱，購自哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司;顯微鏡，購自重慶光學儀器廠。

1.4?試驗方法

（1）人員操作排查。相應批次的試驗人員回顧相關操作，分析可能的風險環(huán)節(jié)。（2）工作種子庫排查。領取1支工作種子，吸取100 μL，稀釋一定倍數后涂布TSA平板，培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)，并挑取單菌落進行鏡檢。（3）一級種子排查。領取1支工作種子，接種于YPG培養(yǎng)基中，于 30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取1 mL發(fā)酵液稀釋至一定倍數后涂布平板，培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)，并挑取單菌落進行鏡檢。（4）濾芯檢查。拆下壓縮空氣管路及發(fā)酵罐上的濾芯，檢查外觀，并進行完整性測試。（5）空培試驗。30L發(fā)酵罐設置攪拌轉速300 r/min、培養(yǎng)溫度30 ℃、通氣量 10 L/min，不進行接種，空培72 h后，觀察是否有雜菌生長現象。210 L發(fā)酵罐設置攪拌轉速 300 r/min、培養(yǎng)溫度30 ℃、通氣量100 L/min，不進行接種，觀察是否有雜菌生長現象;空培48 h后，若210 L發(fā)酵罐未染菌，則進行甘油、甲醇補料操作，觀察是否有雜菌生長現象;空培72 h后，若210 L發(fā)酵罐未染菌，則模擬移種操作，將30L發(fā)酵罐中未染菌的培養(yǎng)基按正常移種操作移入210 L發(fā)酵罐中繼續(xù)空培48 h，觀察是否有雜菌生長現象。（6）接種培養(yǎng)。對空培正常的30 L發(fā)酵罐進行接種，按照“（5）空培試驗”中的培養(yǎng)條件進行二級種子培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后無菌取樣鏡檢，涂布平板培養(yǎng)，檢查是否有染菌。（7）菌體檢查。在超凈工作臺中無菌刮取最近批次的發(fā)酵菌體，適當稀釋后涂布于平板上，37 ℃ 培養(yǎng)2～3d，觀察是否有雜菌生長。（8）染菌判斷。在培養(yǎng)過程中觀察pH值是否有明顯變化（波動大于1表示變化明顯），溶氧量（由發(fā)酵罐自帶電極測量）有無明顯下降（波動大于20%表示變化明顯），發(fā)酵液顏色是否澄清，是否有異常氣味，鏡檢觀察是否有雜菌等，若有其中1項發(fā)生明顯變化，則認為發(fā)生染菌。

2.2.8?染菌調查試驗小結

（1）經過試驗人員的回憶與分析，存在一些不規(guī)范操作;（2）NLF22 30L發(fā)酵罐在進行空培、取樣操作、接種操作、二級種子培養(yǎng)的過程中，通過取樣鏡檢并稀釋涂平板，未發(fā)現有染菌現象;（3）C-plus 30 L發(fā)酵罐在空培過程中發(fā)生染菌，經過對取樣閥進行嚴格處理和更換密封圈后進行空培及二級種子培養(yǎng)，未發(fā)現染菌現象;（4）P 210 L發(fā)酵罐進行了空培、取樣、移種、補料等操作，共進行160h的試驗，未發(fā)現有染菌現象;（5）不同發(fā)酵罐最近發(fā)酵的菌體均未出現染菌;（6）分析染菌原因，可能是存在不規(guī)范的試驗操作現象。C-plus 30 L發(fā)酵罐取樣閥的設計造成密封圈極易磨損。

2.3?預防及糾正措施

筆者所在公司的車間環(huán)境為GMP條件，發(fā)酵罐均為進口的全自動發(fā)酵系統(tǒng)，且發(fā)酵規(guī)模遠小于大宗產品，因此環(huán)境和設備所帶來的影響較小。然而，由于在研發(fā)階段一些操作未被寫入相關文件中，并且一些員工入職時間短，因此筆者從生產流程和人員入手，對可能造成染菌的環(huán)節(jié)采取預防及糾正措施，并以文件的形式固定下來，并對相關人員進行了系統(tǒng)培訓，具體措施如下。

2.3.1?溶液滅菌

2.3.1.1?搖瓶溶液的滅菌?（1）搖瓶溶液滅菌結束后應讓滅菌鍋自然降溫至100 ℃以下，使壓力降至0 MPa，嚴禁直接手動卸壓，否則會因壓力下降過快造成封口膜鼓脹甚至松脫。（2）搖瓶溶液在用滅菌鍋滅菌后應及時開蓋并取出，放置于桌面或超凈臺內自然冷卻，用75%乙醇表面消毒后置于超凈工作臺內，不得放在水池內用純化水冷卻。

2.3.1.2?補料溶液的滅菌?（1）滅菌前應將補料軟管插針套筒前端旋開，并檢查內部棉塞的狀態(tài)，如果有變色或異味應立即更換。插針套筒頂端應避免靠近滅菌鍋底部，防止滅菌過程中混入不潔凈的水。（2）檢查補料瓶呼吸過濾器的狀態(tài)，如發(fā)現破損、變形、進水、變色，應立即更換。在呼吸過濾器上標明開始使用的日期，并在每次滅菌前標記滅菌的次數，重復滅菌滿20次后立即更換。（3）與四閥組對接的隔膜閥在滅菌時應使其處于開啟狀態(tài)，滅菌結束取出補料瓶時應旋緊隔膜閥。（4）溶液在滅菌前需要確認呼吸器正常、軟管已被止血鉗夾緊。

2.3.2?搖瓶接種?（1）接種前開啟紫外燈照射搖瓶溶液的時間不少于30 min。（2）搖瓶用75%乙醇噴灑消毒后放入超凈工作臺內，開啟風機吹干搖瓶外壁。（3）用帶濾芯的吸頭進行接種。

2.3.3?將種子液轉移至接種瓶中?搖瓶揭開封口膜后，將瓶口立即靠近乙醇燈火焰并旋轉瓶身，對瓶口進行烘烤。倒種子液時，接種瓶不應放在雙人超凈工作臺的中間位置。

2.3.4?發(fā)酵準備工作?（1）發(fā)酵罐檢漏。發(fā)酵罐定期做保壓測試，對于發(fā)現泄漏的地方應采取措施解決。（2）30 L發(fā)酵罐的清洗。發(fā)酵罐的清洗要全面，將30 L發(fā)酵罐的可拆卸零部件浸泡于堿液中，包括墊圈、電極堵頭、空氣過濾器外殼等。30 L發(fā)酵罐的清洗過程包括3步：（1）用純化水清洗干凈;（2）用0.25 mol/L堿液浸泡2 h以上;（3）用純化水沖洗干凈。用堿液浸泡時，需要打開發(fā)酵罐底閥和取樣閥，確認堿液與閥芯充分接觸進行浸泡，在取樣閥與底閥出口處連接軟管并用止血鉗夾緊。

2.3.5?30 L發(fā)酵罐的滅菌?在對30 L發(fā)酵罐進行滅菌的過程中，對取樣閥和底閥進行同步滅菌。

2.3.6?30 L發(fā)酵罐種子的培養(yǎng)?在30 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中，應調節(jié)尾氣閥門，使罐壓維持在 20 kPa。

2.3.7?30～210 L發(fā)酵罐的移種?（1）對移種管路滅菌30 min，在滅菌過程中注意觀察接頭部分是否有蒸汽泄露。（2）將移種管路接頭部分的墊圈浸泡于堿液中，使用前清洗干凈，如有變形或破損，應立即更換。（3）在移種過程中，保持30 L發(fā)酵罐的進氣和排氣處于通路狀態(tài)，并調節(jié)尾氣閥，維持罐壓在50 kPa左右。

2.3.8?過程取樣?（1）取樣前后都需要對取樣管路進行蒸汽滅菌，時間設為5～6 min。滅菌時遵循蒸汽流動方向依次打開取樣管路上的隔膜閥，滅菌結束后則倒序關閉隔膜閥。（2）210 L發(fā)酵罐取樣時先打開隔膜閥，后打開取樣閥。在發(fā)酵過程中，每隔24 h通過取樣鏡檢及平板涂布來判斷是否染菌。

2.3.9?210 L發(fā)酵罐滅菌?在滅菌過程中注意觀察閥組、堵頭部分是否有泄露;滅菌完成并冷卻至設定溫度進入保壓模式后，注意觀察罐壓的變化。

2.3.10?210 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程的補料?（1）四閥組補料口對接后滅菌30 min。（2）開啟補料閥組時，注意開啟對應的四閥組，不要錯開未滅菌的補料四閥組。（3）注意推閥的開啟和關閉狀態(tài)，防止在補料過程中軟管崩開。

2.3.11?維護保養(yǎng)?（1）30 L發(fā)酵罐進氣端濾芯暫定半年更換1次，每批在放罐后拆下并觀察有無明顯污染、變形或松動。（2）210 L發(fā)酵罐進氣端空氣過濾器暫定2批次更換1次，尾氣濾芯每批次更換1次，如需延長使用次數，則應在使用前進行完整性測試，檢測合格后方可繼續(xù)使用。（3）每個批次均對發(fā)酵罐密封圈進行檢查。（4）每個季度均對發(fā)酵罐進行維護保養(yǎng)。（5）每個月均對超凈工作臺采用0.2%新潔爾滅/75%乙醇擦拭輪換進行消毒;每個月對滅菌鍋內的水進行更換。

2.3.12?GMP管理方面?（1）完善操作人員的交接班記錄。（2）對相關人員定期進行GMP知識、車間管理、發(fā)酵操作等方面的培訓。（3）將“2.3.1”節(jié)至“2.3.11”節(jié)中的內容整合進發(fā)酵罐的操作規(guī)程及工藝規(guī)程中。（4）升級工藝規(guī)程和發(fā)酵罐SOP。