響應面法優化仙茅多糖酶解工藝及體外免疫活性

楊玲 陳陽 楊小生 楊娟

摘要：采用葡聚糖酶對仙茅多糖XMP-1進行酶解，并利用響應面法對酶解工藝進行合理優化。在單因素試驗的基礎上，采用星點設計模擬葡聚糖酶酶添加量、酶解溫度、時間、pH值等4個因素對還原糖生成量綜合影響的模型，得到最佳工藝條件，并驗證模型的可靠性。通過小鼠巨噬細胞（RAW264.7）分析XMP-1 1～12 h酶解得到的12批產物的體外免疫活性。結果表明，最佳酶解工藝為酶添加量為56%，溫度為52 ℃，酶解時間為12 h，pH值為6.0，此時還原糖生成量為0.201 0 mg/mL。優化結果可靠，與預測值的相對誤差小于5%。不同時間段酶解產物對細胞無明顯毒害作用，均能誘導RAW264.7細胞活化，釋放TNF-α和NO，其中酶解5 h的效果最好。該研究可為仙茅多糖酶降解片段的制備提供理論基礎，也可為仙茅多糖在食品領域進一步開發和應用提供科學依據。

關鍵詞：仙茅;多糖;葡聚糖酶;酶解工藝;響應曲面法;體外免疫誘導活性

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0229-09

收稿日期：2019-03-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：81460597）;貴州省科技平臺及人才團隊計劃（編號：黔科合平臺人才[2017]5614）。

作者簡介：楊?玲（1991—），女，貴州畢節人，碩士研究生，研究方向為天然藥物成分及生理活性。E-mail：18275269165@163.com。

通信作者：楊?娟，博士，研究員，主要從事多糖及寡糖研究。E-mail：yangxz2002@126.com。

仙茅作為石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根莖，是臨床常用的辛熱藥之一，主要用于治療腎陽不足、虛癆內傷、腰膝冷痛、筋骨痿軟等虛寒癥狀[1-2]。它的組成成分主要包括酚性化合物及酚苷、三萜皂苷、植物多糖、木脂素苷類、黃酮類化合物、苯環取代物、揮發油等[3-4]。藥理研究結果顯示，仙茅具有抗氧化、增強免疫力、延緩生殖系統老化、抗骨質疏松、保肝、保護心血管等作用[5]，仙茅多糖具有免疫調節、對抗腫瘤藥氟尿嘧啶減毒增效、加強青蛙心臟的收縮、抗骨質疏松等作用[6]。目前對于仙茅多糖成分的研究只有國內外少量文獻報道，且主要研究其藥理作用，而將仙茅多糖酶解為寡糖的研究尚未見報道。

由于多糖是通過其特異性寡聚糖片段與受體相結合而介導免疫反應的，因此對寡聚糖活性片段進行研究對探討仙茅多糖作用機制具有關鍵作用[7-8]。降解多糖的方法主要有化學、物理和酶降解法等;酸降解法和氧化降解法是常用的化學降解法，簡單易行，但是對于降解產物的聚合度難以控制，降解得率低;目前大多數物理降解方法還只是處于實驗室階段，還需要進行更深入的研究;酶降解法與化學、物理降解法相比，具有反應條件溫和、產物均一性好、聚合度適中、得率高、無污染等優點，且能最大程度地保護反應底物的活性基團不受破壞[9-10]。選擇合適的降解酶對多糖進行酶法修飾，不僅可以更好地探討多糖的結構與功能關系，進而探尋多糖的活性中心，而且可為藥物篩選提供各種結構類型的候選化合物[11]。另外，植物多糖雖然來源豐富，性質穩定，但其分子量大，黏度大，擴散困難，結構復雜，導致其的吸收受到阻礙，進而使其應用范圍受到限制。將植物多糖降解成適宜的、較低分子量的寡糖片段，能夠使其結構更為清晰[12]。寡糖由于結構相對簡單，有人工合成的可能性，其溶解性、穩定性和安全性相對較好[13]。因此，對多糖進行酶法修飾已成為多糖構效關系研究的重要手段，也是發現和研制糖類藥物的重要途徑。本研究利用響應面法優化仙茅多糖葡聚糖酶酶解工藝，并用小鼠巨噬細胞RAW264.7分析不同時間段酶解產物的體外免疫誘導活性，以期為仙茅多糖低分子量降解片段的制備提供理論基礎，對深入研究仙茅多糖構效關系及更好地開發利用仙茅多糖具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

仙茅，購自貴州省貴陽市萬東橋藥材市場，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根，干燥粉碎過40目篩。Sephadex G-50層析柱，美國Pharmacia Sweden公司;DEAE纖維素柱，上海恒信化學試劑有限公司;小鼠巨噬細胞系RAW264.7，中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫;DMWM培養基、胰酶（HyClone，J140032）、Mouse TNF-α ELISA試劑盒（DKW12-2012-096）、NO檢測試劑盒（BLUEGENE，E03N0041），北京達科為生物技術有限公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二甲基四氮D唑溴藍（MTT，822A055），北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（FBS，20150914），浙江天杭生物科技股份有限公司;其他試劑均為國產分析純。

自動部分收集器（BS-100A），上海精科實業有限公司;紫外可見分光光度計（UV-1800），日本島津儀器有限公司;旋轉蒸發儀（Buchi R114），Switzerland公司;數顯恒流泵（HL-2B），上海精科實業有限公司;數顯加熱磁力攪拌器（C-MAG HS 7），德國IKA集團;酶聯免疫檢測儀（1510）、水套式CO2培養箱（USA3131），美國熱電公司;倒置顯微鏡（03040108），日本尼康公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?仙茅粗多糖的提取及分離純化

用80%乙醇回流提取仙茅干藥粉2次，每次2 h，除去低聚糖、單糖及脂溶性成分后，按照仙茅干藥粉和蒸餾水的料液比為1 g ∶35 mL，沸水浴提取150 min，然后將提取液濃縮至黏稠狀，5倍無水乙醇醇沉，靜置過夜，干燥得到仙茅粗多糖。對仙茅粗多糖采用DEAE-纖維素柱進行層析（Φ12.6 cm×100 cm），流速為5 mL/min，40 min/管，用純凈水進行洗脫;再經Sephadex G-50凝膠柱層析進行純化（Φ 2.6 cm×85 cm），流速為1.2 mL/min，6 min/管，用純凈水進行洗脫。凝膠滲透色譜法：Agilent PL aquagel-OH MIXED色譜柱（7.5 mm×300 mm，8 μm），流動相為0.05 mol/L Na2SO4溶液，流速為 1.0 mL/min，溫度為35 ℃，進樣量為80 μL，檢測器為示差折光檢測器;用流動相溶解10 mg多糖樣品于10 mL容量瓶中，進行高效液相色譜分析。凝膠滲透色譜法測定結果分析：采用以標準品的相對分子質量對數與對應的洗脫體積繪制標準曲線，再根據樣品洗脫體積求得其相對分子質量[14]。對仙茅多糖純化后樣品進行純度鑒定。

1.2.2?仙茅多糖的酶解工藝及評價指標

取純化后的仙茅多糖30 mg加5 mL純凈水→50 ℃下攪拌30 min使其充分溶解→加入16.8 mg葡聚糖酶、15 mL pH值為6的KH2PO4/K2HPO4緩沖液→52 ℃ 下反應12 h→沸水浴15 min終止反應→過濾→濃縮至10 mL→酶解產物的混合物。

從酶解產物中分別移取2 mL置于30 mL具塞試管中，加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液 3 mL，混合均勻后，沸水浴7 min，急速冷卻，補水至25 mL。以還原糖含量為指標，繪制葡萄糖標準曲線：y=0.801 1x+0.006 8（r2=0.999 8，線性范圍為0.08～0.48 mg/mL），計算酶解產物的還原糖含量。

1.2.3?仙茅多糖酶解工藝的單因素試驗

考察酶添加量、溫度、時間、pH值對仙茅純多糖酶解得到的還原糖含量的影響。在酶解溫度為55 ℃、時間為10 h、pH值為5.5條件下，設酶添加量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%;在酶添加量為50%、時間為10 h、pH值為5.5條件下，分別設酶解溫度為10、20、30、40、50、60、70 ℃;在酶添加量為50%、溫度為50 ℃、pH值為5.5條件下，分別設酶解時間為3、6、9、12、15、18 h;在酶添加量為50%、溫度為50 ℃、時間為 12 h 條件下，分別設pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，對仙茅多糖酶解工藝進行單因素試驗。

1.2.4?響應面法優化試驗

在單因素考察基礎上，以酶添加量（A）、溫度（B）、酶解時間（C）、pH值（D）為自變量，還原糖生成量為響應值。采用Design Expert 8.05軟件進行4因素5水平星點設計試驗[15-16]，具體見表1。

在含有10%胎牛血清（FBS）、1 mL 10.25%胰酶的90% DMEM培養基接種小鼠巨噬細胞系RAW 264.7細胞，在溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細胞培養箱中進行傳代培養[17]。在酶添加量為56%、溫度為52 ℃、pH值為6.0條件下，試驗組為100 mg仙茅純多糖酶解1～12 h，分別得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h等12批酶解產物濃縮干燥，配制成濃度為31.250、125.000、500.000 μg/mL 溶液;空白組（BC）：以DMEM培養基作為空白對照;多糖組（XMP-1）：將未酶解的濃度為 125.00 μg/mL 的仙茅多糖溶液命名為XMP-1，作為多糖組。以每孔106個細胞的濃度將RAW264.7細胞接種于96孔（100 μL/孔）細胞培養板中，加入試驗組、空白組和多糖組溶液各100 μL，置于溫度為 37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養箱中孵育 48 h。細胞孵育完成后，每孔加入20 μL MTT，繼續培育 4 h 后終止培養，吸取上清，每孔加150 μL二甲基亞砜DMSO，低速（100 r/min）搖床10 min，靜置 20 min，待結晶溶解后用酶標儀于490 nm處檢測吸光度。根據以下公式計算細胞存活率。

存活率=（D藥物-D本底）/（D正常-D本底）×100%。

1.2.6?RAW264.7細胞免疫因子TNF-α測定

細胞接種同“1.2.5”節。于溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細胞培養箱中培養24、36、48 h，細胞孵育完成后，收集細胞培養上清;然后根據小鼠TNF-α ELISA kit說明手冊中進行操作，最后根據標準曲線（y=224.13x-98.989，r2=0.988 6）計算細胞因子TNF-α的濃度[18-19]。

1.2.7?酶解組分誘導RAW264.7細胞活化釋放免疫因子一氧化氮（NO）

采用Griess法測定RAW264.7細胞釋放的NO量[20]，細胞接種同 “1.2.5” 節。于溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細胞培養箱中分別培養24、36、48 h后，加入100 μL Griess試劑[含3 mmol/L磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽，質量分數25%冰乙酸]，室溫避光孵育20 min，離心取細胞上清液，用酶標儀于 450 nm 處測定吸光度，最后根據標準曲線（y=73.86x-3.506，r2=0.988 2）計算NO含量。

1.2.8?數據處理及統計

活性試驗獲得的數據采用GraphPad Prism 7.00進行分析，并與空白對照組進行比較。

2?結果與分析

2.1?仙茅粗多糖的分離純化

運用DEAE纖維素柱對20 g仙茅粗多糖進行初步純化，用純凈水洗脫自動收集器分部收集，苯 酚- 硫酸法檢測，以洗脫管數為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到一個單一峰（圖1），收集單一峰對應部分溶液并濃縮，經Sephadex G-50凝膠柱進一步純化，用純凈水洗脫，收集吸光度最大的單一峰對應的物質，濃縮干燥，命名為XMP-1（圖2）;經凝膠滲透色譜分析發現，色譜峰為單一對稱峰（圖3），可判斷所得純化產物為分子量分布均一的多糖。

2.2?單因素試驗結果

2.2.1?酶添加量對還原糖生成量的影響

由圖4可知，在一定范圍內還原糖的生成量與酶添加量呈正相關關系，在酶添加量為50%時達到最大值。因此選擇50%為酶添加量最佳值。

2.2.2?酶解溫度對還原糖生成量的影響

酶活性的發揮存在最適合的溫度，低于或超過該值，酶活性的發揮都會受到影響。從圖5可以看出，當溫度在50 ℃以下時，溫度的增加有利于還原糖的生成。因此選擇50 ℃為酶解溫度最佳值。

2.2.3?酶解時間對還原糖生成量的影響

從圖6可以看出，在酶解時間為12 h內，還原糖的產生量隨酶解時間的增加迅速增加，說明葡聚糖酶對 XMP-1的作用有一個逐漸修飾的過程;在酶解時間為12 h之后，還原糖稍有生產量減少。因此酶解時間為12 h最為合適。

2.2.4?pH值對還原糖生成量的影響

從圖7可以看出，在pH值為6.0時，還原糖生成量達到極大值，說明葡聚糖酶活性的發揮有最佳的pH值，越接近該pH值，越有利于酶活性的發揮。因此選擇6.0為pH值最佳值。

2.3?響應面法優化試驗結果

2.3.1?星點設計試驗和結果

基于單因素考察結果，運用響應面-星點設計法優化仙茅多糖酶解工藝，結果見表2、表3，其中表2為星點設計試驗和結果，表3為多糖酶解優化工藝所建立回歸方程的方差分析。

2.3.2?回歸方程的建立及顯著性檢驗

通過Design-Expert 8.0.5b軟件對表3中的試驗結果進行多元線性回歸二項式擬合，得到的方程為Y=-0.91605+1.55458A+7.18988×10-3B+0.065132C+0.037327D-1.75421×10-3AB-3.60074×10-3AC+6.83217×10-3AD-1.38490×10-5BC+3.87772×10-5BD-3.97004×10-4CD-1.40070A2-6.00698×10-5B2-2.401 74×10-3C2-3.006 98×10-3D2，R2=0.999 1，其中Y為還原糖生長量，可以看出，方程可信度較好，可以較準確地評估多糖的酶解工藝。從表3可以看出，模型的P值小于0.000 1，說明試驗因素對試驗結果影響極顯著，該模型具有較好的分析預測意義。失擬項的P值等于 0.343 3，大于0.05，說明它對試驗結果影響不顯著，說明方程擬合程度較好，可用于預測試驗結果。各因素方差分析結果顯示，對于一次項和二次方項：酶添加量、溫度、酶解時間、pH值及其各自二次方項皆對還原糖生成量的影響極顯著（P<0.001）;對于交叉項：酶添加量和溫度的交互作用對還原糖生成量的影響極顯著（P<0.001）;酶添加量和酶解時間的交互作用、酶添加量和pH值的交互作用、酶解時間和pH值的交互作用對還原糖生成量的影響高度顯著（P<0.01）;溫度和pH值的交互作用對還原糖生成量的影響不顯著（P>0.05）;表明各因素與還原糖生成量之間不是簡單線性關系。由F值可得，4因素對還原糖生成量的影響次序為酶添加量>酶解時間>溫度>pH值。最優條件是酶添加量為56%，溫度為 52.32 ℃，酶解時間為12.46 h，pH值為6.36，此時還原糖生成量期望值為0.201 9 mg/mL。

2.3.3?響應曲面分析

采用軟件Design-Expert獲得響應值的3D曲面，分析各因素對還原糖生成量的影響及各因素間的交互作用，即當固定酶添加量、溫度、酶解時間、pH值中任意2個因素為零水平時，其他2個因素間的交互作用對還原糖生成量的影響。從圖8可以看出，還原糖生成量隨其中任意2個因素量的增加均呈上升趨勢，達到一定值之后，稍下降或趨于平緩。各因素之間具有交互作用。

2.3.4?驗證與優化

通過響應面法優化XMP-1的最佳酶解條件，結合實際操作，將優化條件調整為酶添加量56%、溫度52 ℃、酶解時間12 h、pH值 6.0，在此條件下進行試驗，平行檢測5次，所測的還原糖生成量為0.201 0 mg/mL，與期望值的相對誤差在5%以內，二者較吻合。所以該方法能較好優化XMP-1的酶解條件，具有較好的可信度。

2.4?不同時間段酶解產物的體外免疫誘導活性

2.4.1?不同時間段的酶解產物對細胞的毒性作用

不同時間段的酶解產物分別孵育48 h后對RAW264.7細胞毒性作用見圖9。通過光學顯微鏡觀察XMP-1對RAW264.7細胞形態的影響，結果發現，XMP-1對RAW264.7細胞的形態沒有造成明顯的影響。XMP-1在31.250～500.000 μg/mL濃度范圍內，孵育48 h后對細胞的生長不會造成明顯影響。所以濃度在500.00 μg/mL以內的XMP-1對RAW264.7細胞是安全無毒性的，可以作為后續試驗的濃度設定上限，這對于各項試驗指標的判斷都具有重要的意義。

2.4.2?不同時間段的酶解產物誘導RAW264.7細胞活化分泌TNF-α的結果

孵育24、36、48 h后，不同時間段的酶解產物對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響見圖10。不同時間段的酶解產物均能誘導RAW264.7細胞活化分泌TNF-α，且誘導活性呈現濃度依賴性。酶解5 h的組分誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α的作用，孵育36 h和48 h時不同濃度的誘導作用均強于多糖組。

2.4.3?不同時間段的酶解產物誘導RAW264.7細胞活化釋放NO的結果

孵育24、36、48 h后，不同時間段的酶解產物誘導RAW264.7細胞活化釋放NO的結果見圖11。結果表明，XMP-1不同時間段的酶解產物均可有效誘導RAW264.7細胞活化分泌NO，孵育36、48 h時，酶解4、5 h的酶解產物在不同濃度條件下都能較好地促進細胞NO的分泌，且都優于多糖組。

3?討論與結論

運用葡聚糖酶對XPM-1進行酶解，在單因素試驗的基礎上考察了XMP-1經葡聚糖酶酶解的最佳條件， 運用星點設計法構建了各酶解條件因素對XMP-1酶解工藝的影響模型，結果表明，該方法擬合程度較好，模型具有設計意義;酶添加量、酶解時間的適當增加以及適宜的pH值和溫度都能增加還原糖的生成量;4因素對還原糖生成量的影響次序為酶添加量>酶解時間>溫度>pH值。將優化條件修正為酶添加量為56%，溫度為 52 ℃，酶解時間為12 h，pH值為6.0后，還原糖量生成量為 0.201 0 mg/mL，與期望值的相對誤差在5%以內，可信度較高，可用于XMP-1酶解工藝的優化。體外免疫誘導活性分析結果表明， 濃度為 500 μg/mL 以下，孵育時間48 h以內，酶解產物對細胞沒有明顯的毒害作用;不同時間段酶解產物均可誘導細胞分泌TNF-α和NO，其中酶解5 h的組分免疫誘導活性較其他時間段效果好。本研究結果可為仙茅在食品和醫藥領域的開發利用及工藝化生產提供一定的理論指導。

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