hpaXm和hpaXm-IP基因對棉花角斑病菌V8表型及HR的影響

王清 張勇躍 孟凡奇 劉志堅 繆衛國

摘要：試驗前期通過構建相應敲除載體，采用電轉化的方法，分別獲得Xanthmonas. citri subsp. malvacearum（簡稱Xcm）菌株的hpaXm基因缺失突變菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突變菌株V8ΔhpaXm-IP。通過特殊生長平板及煙草接種試驗表明，與V8菌株相比，突變菌株胞外多糖產量以及胞外纖維素酶、脂酶活性不變，V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性顯著降低;3種菌株都不能產生胞外蛋白酶;突變菌株在煙草上形成的壞死斑面積變小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因與病菌胞外淀粉酶活性及病菌激發煙草過敏反應的能力有關，與胞外多糖、纖維素酶、蛋白酶和脂酶產生無關。同時預示了hpaXm-IP可能具有牽引HpaXm蛋白泌出的能力，且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激發煙草HR的活性物質，hpaXm及hpaXm-IP可能會影響V8菌株的致病性，但不是必然的。

關鍵詞：棉花角斑病菌;細菌病害;表型;過敏反應;胞外多糖;胞外酶

中圖分類號： S435.621.2+5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0116-04

收稿日期：2019-03-08

基金項目：國家甘薯產業技術體系項目（編號：CARS-10-C-13）;國家自然科學基金（編號：31360029、31160359）;教育部博士點基金（編號：20124601110004、20104601110004）;國家重大基礎研究計劃（編號：2011CB111612）;國家農業產業技術體系建設（編號：CARS-34-GW8）。

作者簡介：王?清（1988—），女，河南項城人，碩士，研究實習員，主要從事植物保護等研究。E-mail：1173823088@qq.com。

通信作者：繆衛國，博士，教授，主要從事分子植物病理等研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。

棉花細菌性角斑病是我國最早報道的重要細菌病害，在整個生育期都可侵染棉花，該病害對棉花生長過程造成較大的負面影響[1]。棉花角斑病菌于2006年正式定名為Xanthmonascitri subsp. malvacearum nov.comb.nov.nom.nov.（簡稱Xcm）[2]，屬黃單胞菌屬的革蘭氏陰性細菌，在含有營養瓊脂的培養基平板上，菌落形態為近圓形，顏色逐漸由淡黃色變為蠟黃，邊緣完整且微凸[1]。1986年決定病原菌對寄主植物致病性和誘導非寄主及抗病植物過敏性反應（HR）的hrp基因在菜豆暈斑病菌中被首次報道[3-4];1992年，人們從梨火疫病菌中發現由hrpN基因編碼的第1個Harpin類蛋白HarpinEa[5]，隨后眾多由hrp類基因編碼的Harpin蛋白相繼被克隆表達出來，目前大部分Harpin蛋白可激發煙草HR、異位效應等，且具有促生長等作用[6]，對應編碼基因被普遍研究。由于棉花角斑病菌V8小種存在限制性修飾系統，一直未能對其特定基因進行定點突變[7]，因此關于hpaXm、hpaXm-IP基因對V8小種生物學特性和煙草過敏反應的影響暫未見報道。

hpaXm基因是從V8小種XCM143基因組DNA中克隆的全長為402 bp的序列[6]，能編碼定位于hrp區域的Harpin類蛋白HpaXm。繆衛國通過信號肽軟件Signal 3.0 server對蛋白的二級結構進行預測和GST-HpaXm融合蛋白的表達進行檢測，結果顯示，HpaXm的N端前15個氨基酸是存在的信號肽，且信號肽缺失后該蛋白不能正常泌出胞外，hpaXm-IP則是編碼該信號肽的長為45 bp的基因序列[2]，這預示HpaXm蛋白的泌出方式可能不同于其他Harpin蛋白。本研究將突變菌株V8ΔhpaXm和V8Δhp6aXm-IP進行特殊營養瓊脂培養基平板、營養肉湯培養基培養基生長試驗以及煙草HR測定，分析hpaXm及hpaXm-IP基因對V8菌株生物學特性及其激發煙草HR能力的影響，以期為后續突變菌株致病性、Harpin蛋白泌出途徑及缺失N端45個氨基酸對Harpin蛋白的影響等相關研究提供相關科學參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?相關基因?hpaxm基因從Xcm基因組中通過PCR擴增獲得;hpaXm-IP基因為hpaxm基因中長為45 bp的編碼HpaXm蛋白N端類似信號肽序列的一段基因。

1.1.2?菌株?試驗用菌株棉花角斑病菌（Xanthmonas. citri subsp. malvacearum，Xcm）V8菌株（8號小種）從棉花上分離獲得，V8ΔhpaXm-IP以hpaxm為靶基因構建敲除載體通過電轉化野生菌Xcm同源重組獲得;V8ΔhpaXm菌株以hpaXm-IP為靶基因構建敲除載體通過電轉化野生菌Xcm同源重組獲得[7]。

1.1.3?敲除載體?敲出載體的詳細構建過程參照文獻[7]。

1.1.4?植物?以盆栽種植的6～8葉期本氏煙煙株為試驗植物。

1.1.5?試劑?氯化鈉、牛肉浸膏、蔗糖、胰化蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、氫氧化鈉[生工生物工程（上海）股份有限公司];卡那霉素、脫脂牛奶、可溶性淀粉、碘、碘化鉀、羧甲基纖維素、剛果紅、二水合氯化鈣等（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.6?培養基?NB培養基：5 g聚蛋白胨，3 g牛肉浸膏，1 g酵母粉，10 g蔗糖，加水900 mL，攪拌至均勻，用5 mol/L NaOH調節pH值至6.8，定容至 1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。NA培養基是在NB培養基的基礎上加入20 g瓊脂配制而成的。

1.2?菌株生物學特性的研究

胞外多糖產量的測定參考馮雯杰的方法[8]，胞外酶等活性的測定參考Slater等的方法[9]，其中胞外酶活性以水解圈或者透明圈直徑和菌落直徑大小的比值表示。

1.3?菌株激發的煙草過敏反應

菌株激發的煙草過敏反應參考李小杰的方法[10]進行檢測。

2?結果與分析

2.1?hpaXm及hpaXm-IP基因對V8菌株胞外多糖產量的影響

從圖1可以看出，突變菌株1、3和野生菌株2的菌落形態及顏色基本一致，均表現為豐滿、隆起，表面光滑且具光澤;統計學分析結果（圖2）表明，突變菌株與V8菌株的胞外多糖產量并無顯著差異。說明hpaXm及hpaXm-IP基因不具有調控V8菌株胞外多糖合成與泌出的作用。

2.2?hpaXm及hpaXm-IP基因對V8菌株胞外酶活性的影響

2.2.1?胞外淀粉酶活性變化?突變菌株單菌落周圍形成的透明圈都變小（圖3），統計學分析結果（圖4）表明，V8ΔhpaXm-IP菌株與V8菌株的胞外淀粉酶活性大小無顯著差異;V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性與V8菌株相比則顯著上升。表明 hpaXm-IP基因對V8菌株的胞外淀粉酶活性沒影響，hpaXm基因可在一定程度上抑制V8菌株胞外淀粉酶的活性或產生。

2.2.2?胞外纖維素酶活性變化?從圖5可以看出，各菌株單菌落形成的透明圈大小基本一致，統計結果（圖6）表明，V8ΔhpaXm、V8ΔhpaXm-IP菌株與V8菌株的胞外淀粉酶活性大小均無顯著性差異。表明hpaXm及hpaXm-IP基因與V8菌株胞外纖維素酶的活性無明顯相關關系。

2.2.3?胞外蛋白酶活性變化?從圖7可以看出，3種菌株單菌落在脫脂牛奶平板上都不形成透明圈，表明V8菌株不能產生胞外蛋白酶。統計分析結果（圖8）表明，V8ΔhpaXmV8和V8ΔhpaXm-IP菌株的菌落大小與V8菌株相比均極顯著下降。表明hpaXm、hpaXm-IP基因影響V8菌株在脫脂牛奶平板上的生長能力。

2.2.4?胞外脂酶活性變化?從圖9可以看出，突變菌株的單菌落周圍形成的雪花狀圈與V8菌株相比基本沒變化，表明hpaXm及hpaXm-IP基因的缺失不影響V8菌株產生胞外脂酶的活性。

2.3?hpaXm及hpaXm-IP基因對V8菌株激發煙草HR能力的影響

從圖10可以看出，在接種24 h后，突變菌株與V8菌株在煙草上的接種部位均可形成壞死斑，但突變菌株接種部位的壞死斑面積減小，初步推測，hpaXm及hpaXm-IP基因都能影響V8菌株激發煙草HR的能力。

3?討論與結論

黃單胞菌產生的胞外多糖具有黏附性，能促使細菌附著于葉片上，不僅阻礙宿主水分運輸，還能螯合激發免疫需要的信號Ca2+等，可抑制植物防衛反應機制，從而對其致病性起重要作用[3，11]。胞外酶可以幫助革蘭氏陰性細菌降解摧毀植物的第1道防線——細胞壁，一旦發生分泌缺陷，其致病力會降低[12]。hrp基因突變對革蘭氏陰性病原細菌激發非寄主植物HR和致使寄主植物發病能力的影響并不規律。

hpaXm基因缺失對V8菌株的胞外多糖產量及胞外纖維素酶、脂酶活性無明顯影響，但使V8菌株胞外淀粉酶活性顯著下降，且V8ΔhpaXm在煙草上形成的壞死斑面積變小。據報道，水稻白葉枯病菌一旦不能產生胞外蛋白酶，其致病性變弱且菌體繁殖數量減少[13];甘藍黑腐病黃單胞菌的胞外蛋白酶也可能通過幫助其在寄主中擴展或克服寄主的防衛反應而參與致病過程[14]，本試驗發現，V8菌株自身無法產生胞外蛋白酶。研究表明，hpa2基因突變的野油菜黃單胞菌Xcc 8004激發非寄主植物HR的能力喪失[15];hrpN發生突變會導致梨火疫病菌的致病性和HR完全喪失[16];水稻黃單胞菌的hrpXoo基因則對水稻致病性和煙草過敏反應具有決定性作用[17];但hpaH基因突變后，菌株Xag Bra可激發非寄主植物番茄和白菜上產生HR，而使辣椒和煙草喪失了產生HR的能力[18]。V8ΔhpaXm菌株在煙草上形成壞死斑的面積僅僅變小，并未完全消失，說明hpaXm基因缺失會使V8菌株激發煙草HR的能力下降但不會喪失，hpaXm基因并不完全決定著V8菌株激發煙草HR的能力，HpaXm蛋白也不是V8產生的能夠激發煙草HR的唯一活性物質。

hpaXm-IP基因缺失對V8菌株的胞外多糖產量及胞外纖維素酶、淀粉酶及脂酶活性無明顯影響。V8ΔhpaXm-IP菌株在煙草上形成的壞死斑面積與V8菌株相比變小，說明hpaXm-IP缺失只是降低了V8菌株激發煙草HR的能力。一些Ⅲ型效應蛋白的分泌會依賴其N端序列，如若刪除水稻黃單胞菌基因avrBs1 N端的第1～58個密碼子，其編碼蛋白將無法從T3SS泌出[19]。結合前期的相關預測推測，V8ΔhpaXm-IP菌株激發煙草HR的能力減弱，一方面可能是由于hpaXm-IP具有牽引HpaXm蛋白泌出的能力，hpaXm-IP基因的缺失使得HpaXm蛋白不能正常泌出胞外;另一方面可能是由于HpaXm蛋白激發煙草HR的部分功能區域是其前15個氨基酸片段。很多突變的革蘭氏陰性病原菌通常一旦喪失了激發非寄主植物HR的能力，那么在寄主植物上的致病力也會相應的喪失[20]，至于hpaXm及hpaXm-IP基因是否決定V8菌株在寄主棉花上的致病性，仍需要進一步深入研究。

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