內蒙古自治區馬鈴薯病毒病的檢測

魏瑤 劉燕 圖門白拉 趙明敏

摘要：馬鈴薯病毒病是我國馬鈴薯作物常見病害之一，是影響馬鈴薯生產的重要因子。內蒙古自治區是我國最大的馬鈴薯種植區。目前，內蒙古自治區引起馬鈴薯病毒病的病原種類尚不清楚。利用反轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）技術對內蒙古自治區馬鈴薯主要種植產區幾種常見的病毒病進行檢測。結果表明，在27份樣品中有11份樣品為復合侵染，15份為單獨侵染。其中，6個樣品為馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡稱PVY）和馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，簡稱PLRV）的復合侵染;2份樣品為PVY和馬鈴薯M病毒（potato virus M，簡稱PVM）的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和馬鈴薯S病毒（potato virus S，簡稱PVS）的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVM的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV、PVM和馬鈴薯A病毒（potato virus A，簡稱PVA）的復合侵染。15份單獨侵染的樣品中均檢測到PVY。27份樣品中均未檢測到馬鈴薯X病毒（potato virus X，簡稱PVX）。由此可見，無論復合侵染還是單獨侵染均檢測到PVY。說明PVY是引起當地馬鈴薯病毒病的主要病原之一。

關鍵詞：馬鈴薯病毒病;反轉錄-聚合酶鏈式反應;植物病毒檢測

中圖分類號：S435.32?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0111-05

收稿日期：2019-09-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：31770165）;內蒙古農業大學高層次人才引進科研啟動項目（編號：NDGCC2016-23）。

作者簡介：魏?瑤（1996—），女，內蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事馬鈴薯病毒病的研究。E-mail：weiyao2018@163.com。

通信作者：趙明敏，博士，教授，博士生導師，主要從事植物病毒學的教學和科研工作。E-mail：mingminzh@163.com。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）原產于南美洲安第斯山地區[1]，屬于一年生茄科茄屬作物，是世界第四大糧食作物，具有很高的營養價值和商品價值。馬鈴薯病毒病是導致馬鈴薯退化的根本原因，被病毒侵染后一般減產20%～50%，嚴重的達80%[2]，病毒病長期以來是制約馬鈴薯生產的重要因素。目前，盡管生產上多采用的脫毒種薯能夠在一定程度上減輕病毒病的危害，但生長中后期田間的病毒再次侵染也可導致產量的大幅度降低。因此，無論在脫毒種薯生產，還是大田栽培中，馬鈴薯病毒病的檢測對保證馬鈴薯穩產、高產至關重要。目前，已報道的感染馬鈴薯的病毒多達35種以上，其中危害嚴重的有6～7種，包括馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，簡稱PVA）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，簡稱PVX）等。隨著病毒檢測技術的發展，發現幾乎所有的馬鈴薯品種均受到一種或幾種病毒的復合侵染[3]。黃遵錫等對田間幾種較嚴重的病毒病害進行了免疫電鏡鑒定，分別觀察到PVX、PVY、煙草花葉病毒（TMV）、煙草蝕紋病毒（TEV）病毒粒體及其上的套環結構[4]。分子生物學檢測技術從核酸水平檢測植物病毒，靈敏度高、特異性強，能克服血清學及其他檢測方法中的缺點，可以進行大批量的樣本檢測，是目前發展最快、最有發展前景的病毒檢測技術[5]。反轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）檢測快速、靈敏度高、特異性強，在病毒檢測中越來越顯示出強大的優勢，在馬鈴薯病毒檢測中應用廣泛[6]。

本研究利用RT-PCR技術對內蒙古自治區馬鈴薯主要種植產區6種病毒病進行檢測。研究結果可為馬鈴薯脫毒種薯生產過程中病毒病的檢測以及馬鈴薯病毒病的防治提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

2018年在內蒙古呼和浩特市、烏蘭察布市等地區采集疑似馬鈴薯病毒病病株葉片，共27份 （表1），液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.1.1?主要試劑和儀器

主要試劑有TRIzol RNA提取試劑、DNA Marker、6×DNA loading buffer，均購自天根生化科技（北京）有限公司;隨機引物、反轉錄試劑、PCR mix，均購自Promega公司;rTaq酶、10×PCR buffer、2.5 mmol/L dNTP，均購自TaKaRa公司。

主要儀器包括Eppendorf移液器、BIO-RAD My Cycler PCR儀、BIO-RAD凝膠成像系統等。

1.1.2?引物的設計與合成

根據文獻報道相應病毒基因序列設計引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?試驗方法

1.2.1?植物總RNA提取

以感染馬鈴薯病毒病植株的葉片和健康葉片為試驗材料，稱取0.1 g植物組織，采用TRIzol法提取植物總RNA。

1.2.2?RT-PCR檢測

反轉錄體系：以提取的總RNA為模板，用Promega試劑盒，合成第1條鏈，反應體系在0.2 mL的PCR管中進行，依次加入 0.5 μL Random primers、1 μg RNA，用Nuclease-Free Water補足至5 μL，混勻，在65 ℃ PCR儀中溫育5 min;之后加4 μL 5×Reaction buffer，3.8 μL MgCl2，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.5 μL Recombinant RNasin@ Ribonuclease Inhibitor，1 μL Reverse Transcriptase，4.7 μL Nuclease-Free Water;混勻，在PCR儀中25 ℃、5 min，37 ℃、1 h，70 ℃、15 min 合成cDNA，直接進行PCR擴增或置于-20 ℃冰箱中保存。

PCR擴增程序與凝膠電泳：根據不同引物調整退火溫度，主要采用以下PCR擴增程序：在25 μL反應體系中，加入2 μL cDNA，1 μL引物-F，1 μL引物-R，0.5 μL rTaq酶，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，16 μL dd H2O，反應條件為 94 ℃ 預變性3 min;94 ℃變性30 s，Tm（不同引物的退火溫度）退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環;最后72 ℃延伸10 min。取3 μL擴增產物用2%瓊脂糖進行凝膠電泳，在凝膠成像儀上檢測并照相。

1.2.3?PCR產物測序及分析

將擴增出PVY特異性條帶的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

用MEGA 6.0進行相關序列系統進化樹分析，采用相鄰法（neighbor-joining，簡稱NJ）構建系統發育樹。

2?結果與分析

2.1?馬鈴薯病毒病發病癥狀

在內蒙古農業大學教學農場馬鈴薯田、內蒙古呼和浩特市武川縣哈樂鎮和內蒙古烏蘭察布市中加農業生物科技有限公司的試驗田進行采樣。馬鈴薯植株癥狀表現有花葉、卷葉、矮化、變色等癥狀（圖1）。

2.2?RT-PCR檢測結果

對27個樣品進行提取總RNA后，獲得cDNA，以cDNA為模板，用引物-F和引物-R進行PCR擴增，結果（表3、圖2）顯示，在27份樣品中，11份樣品為復合侵染，15份為單獨侵染，而第11號樣品未檢測到病毒侵染情況。其中，6份樣品為PVY和PLRV的復合侵染;2份樣品為PVY和PVM的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVS的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVM的復合侵染;1份樣品為PVY、PLRV、PVM和PVA的復合侵染。15份單獨侵染的樣品中均檢測到PVY。27份樣品中均未檢測到PVX。由此可見，無論復合侵染還是單獨侵染均檢測到了PVY。說明PVY是引起當地馬鈴薯病毒病的主要病原之一。

2.3?進化樹分析

為進一步分析PVY與已報道的序列的一致性，對1～18號中有特異性擴增的17個樣品進行測序（其中，13號樣品測序時顯示不合格，測序失?。?。將測序結果與GenBank中已登錄的PVY序列進行比對，構建進化樹，以李痘病毒分離物AnMrPI533（MG 686954）作為外參。結果（圖3）表明，所擴增獲得的PVY片段的序列與GenBank中已登錄的PVY序列相似性很高，其中Y-H-6和Y-H-7樣品在同一分支上，Y-H-3和Y-H-8樣品在同一分支上，他們的親緣關系最近;Y-H-2樣品與PVY-Jessore（MF589764）親緣關系較近。

2.4?序列一致性分析

應用SDTv.1.0軟件分析PVY測序序列與GenBank中已登錄的PVY序列核酸一致性（圖4），以李痘病毒分離物AnMrPI533（MG 686954）作為外參。結果表明，16個樣品測序序列與GenBank中已登錄的PVY序列的一致性達到95%以上。

3?討論

馬鈴薯病毒病是我國馬鈴薯作物重要病害之一，是制約馬鈴薯產業發展的一大難題。目前，生產上脫毒種薯的廣泛應用雖然能夠在一定程度上解決馬鈴薯種薯退化問題，但脫毒種薯質量和大田生產中病毒病的再侵染仍是馬鈴薯生產中尚待解決的首要問題。為進一步明確內蒙古自治區馬鈴薯病毒病的病原是由哪些病毒組成的，本試驗利用 RT-PCR技術在內蒙古自治區馬鈴薯主要種植產區進行了采樣和6種病毒病的檢測研究。

秦亞南曾在內蒙古呼和浩特市周邊6個旗縣（清水河縣、察右中旗、四子王旗、和林縣、卓資縣、武川縣）進行馬鈴薯病毒檢測，通過PCR法檢測了PVX、PVY、PLRV、PVA、PVS、PVM、馬鈴薯帚頂病毒（potato mop-top virus，簡稱PMTV）7個病毒[7]。結果表明，6個地區的病葉樣品中均能檢測到PVY，且檢出率較高，為85.6%。PVX、PLRV總檢出率分別為4.8%、26.4%。PVA、PVM、PVS總檢出率分別為12.0%、1.6%、24.8%。PMTV在6個地區的樣品中檢出率為0。董代幸在新疆馬鈴薯種薯、商品薯的重要生產基地烏魯木齊檢測馬鈴薯病毒，結果表明侵染烏魯木齊地區馬鈴薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV，類病毒為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[8]。其中PVY、PLRV的侵染率最高，其次為PVX、PVA，PSTVd的侵染率較低。顏謙等調查貴州省不同海拔地區馬鈴薯病害發生情況，結果表明，危害貴州省馬鈴薯較重的病毒種類依次為PVS、PVY、PVX、PLRV[9]。

與已有研究結果相似，本研究發現在內蒙古自治區的馬鈴薯病毒病主要是PVY與其他幾種病毒如PLRV、PVM、PVS、PVA的混合侵染。在供試樣品中未檢測到PVX病毒。

很多學者的報道中顯示，無論在脫毒種薯還是大田植株上都很難檢測到PVS病毒。但本研究在內蒙古農業大學教學農場的25號樣品中檢測到了PVS病毒。

參考文獻：

[1]Salazar L F. 馬鈴薯病毒及其防治北京[M].閻文昭，譯. 北京：中國農業技術出版社，2000.

[2]鐘婷婷. 馬鈴薯病毒病RT-PCR檢測體系的建立及病毒病在四川省的種類與分布[D]. 雅安：四川農業大學，2007.

[3]Salazar L F .Potato viruses and their control[M]. Lima：International Potato Center，1996.

[4]黃遵錫，李?紅，陳文久，等. 引起煙草嚴重病害的五種病毒的酶聯免疫及免疫電鏡鑒定[J]. 云南師范大學學報（自然科學版），1997，17（1）：75-81.

[5]董代幸，張祥林，羅?明，等. 馬鈴薯病毒一步法多重RT-PCR檢測技術的構建[J]. 微生物學通報，2011，38（1）：131-137.

[6]吳興泉，時?妍，楊慶東，等. 馬鈴薯病毒的RT-PCR檢測技術評述[J]. 中國馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.

[7]秦亞南. 呼和浩特周邊地區馬鈴薯病毒病的田間調查及分子鑒定[D]. 呼和浩特：內蒙古大學，2018.

[8]董代幸. 烏魯木齊地區馬鈴薯病毒和類病毒的分子鑒定及檢測技術研究[D]. 烏魯木齊：新疆農業大學，2010.

[9]顏?謙，黃?萍，宋吉軒，等. 貴州不同海拔地區馬鈴薯病毒病初步調查及檢測鑒定[J]. 安徽農業科學，2009，37（29）：14262-14263.