HOTTIP在口腔鱗癌中的表達及意義

宋洪寧　雷印濤　邢在臣　劉敏

【摘要】 目的 探討口腔鱗狀細胞癌（OSCC， 簡稱鱗癌）中HOXA遠端轉錄本（HOTTIP）的表達及意義。方法 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）方法檢測HOTTIP在正常人口腔黏膜角質形成細胞（HOK）和人OSCC細胞系（HSC-4）中的表達情況;對HSC-4細胞轉染HOTTIP-inhibitor，?qRT-PCR檢測轉染后HOTTIP的表達量， MTT實驗、細胞劃痕實驗檢測轉染后對HSC-4細胞增殖、遷移的影響。結果 通過qRT-PCR檢測HOTTIP的表達量， HSC-4細胞中的HOTTIP表達量（1.521±0.117）顯著高于HOK細胞的（1.060±0.036）， 差異有統計學意義（P<0.05）;對HSC-4細胞轉染HOTTIP-inhibitor，?qRT-PCR檢測HSC-4細胞轉染后HOTTIP的表達量， HOTTIP-inhibitor組HOTTIP的表達量（0.336±0.070）均明顯低于Control組和Inhibitor-NC組的（1.062±0.092）、（1.023±0.103）， 差異均有統計學意義（P<0.05）;MTT實驗證實HSC-4細胞轉染HOTTIP-inhibitor后， HOTTIP-inhibitor組相對于Control組和Inhibitor-NC組， 細胞增殖能力明顯下降， 差異有統計學意義（P<0.05）， 提示敲低HOTTIP的表達能顯著降低HSC-4細胞的增殖能力;細胞劃痕實驗中， HOTTIP-inhibitor組細胞的劃痕愈合速度減慢， HOTTIP-inhibitor組轉染后24 h細胞劃痕占比（53.27±1.85）均大于Control組和Inhibitor-NC組的（21.10±0.78）、（25.13±1.69）， 差異均具有統計學意義（P<0.05）， 提示HOTTIP的低表達能有效地降低細胞遷移能力。

結論 與HOK細胞相比， HSC-4細胞中HOTTIP表達明顯上調， 敲低HOTTIP的表達能顯著降低HSC-4細胞的增殖能力、遷移能力， 證實其在OSCC中發揮促癌作用。

【關鍵詞】 口腔鱗癌;HOXA遠端轉錄本;腫瘤標志物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.085

Expression and significance of HOTTIP in oral squamous cell carcinoma? ?SONG Hong-ning， LEI Yin-tao， XING Zai-chen， et al. Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical University， Taian 271000， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the expression and significance of HOXA transcript at the distal tip （HOTTIP） in oral squamous cell carcinoma （OSCC）. Methods? ?Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect the expression of HOTTIP in normal human oral keratinocytes （HOK） and human OSCC cell line （HSC-4）. The expression of HOTTIP after transfection was detected by qRT-PCR， and the effects of transfection on proliferation and migration of HSC-4 cells were detected by MTT assay and cell scratch assay. Results? ?The expression of HOTTIP was detected by qRT-PCR. The expression of HOTTIP in HSC-4 cells （1.521±0.117） was significantly higher than? （1.060±0.036） in HOK cells， and the difference was statistically significant （P<0.05）. HSC-4 cells were transfected with HOTTIP-inhibitor. QRT-PCR was used to detect the expression of HOTTIP in HSC-4 cells. The expression of HOTTIP in the HOTTIP-inhibitor group （0.336±0.070） was significantly lower than （1.062±0.092） and （1.023±0.103） in the Control group and Inhibitor-NC group， their differences were statistically significant （P<0.05）. MTT experiments confirmed that after HSC-4 cells were transfected with HOTTIP-inhibitor， the cell proliferation ability of HOTTIP-inhibitor group was significantly lower than that of Control group and Inhibitor-NC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）， suggesting that the expression of HOTTIP can significantly reduce the proliferation ability of HSC-4 cells. In the cell scratch test， the scratch healing speed of the cells in the HOTTIP-inhibitor group was slowed down. The percentage of cell scratches （53.27±1.85） in the HOTTIP-inhibitor group at 24 h after transfection was greater than （21.10.±0.78） and （25.13±1.69） in the Control group and Inhibitor-NC group， and the differences were statistically significant （P<0.05）， suggesting that the low expression of HOTTIP can effectively reduce the cell migration ability. Conclusion? ?Compared with HOK cells， the expression of HOTTIP in HSC-4 cells was significantly up-regulated. Knocking down the expression of HOTTIP can significantly reduce the proliferation and migration of HSC-4 cells， confirming that it plays a pro-cancer role in OSCC.

【Key words】 Oal squamous cell carcinoma; HOXA transcript at the distal tip; Tumor markers

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）在口腔頜面部惡性腫瘤中占比高達80%以上， 每年約有50萬新增病例， OSCC易發生淋巴結轉移， 晚期可發生遠處轉移， 經治療后， 患者5年生存率只有50%～60%[1]， 預后較差， 腫瘤的局部復發和遠處轉移特性是治療失敗的最重要因素[2]， 其發病機制尚未闡明。因此， 探索與OSCC發生、發展和預后相關的生物學標記物顯得十分重要。近年來許多研究證實[3， 4]，

在許多惡性腫瘤中， 都會存在一個共同現象即長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）的異常表達， 其與腫瘤的發生發展關系密切， HOXA遠端轉錄本（HOXA transcript at the distal tip， HOTTIP）屬于lncRNA的一種， 研究發現其在多種惡性腫瘤中的表達同樣具有差異性， 并通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡、轉移等參與腫瘤的形成和發展[5-7]。但關于其在OSCC中的表達情況的研究甚少， 本研究采用qRT-PCR方法檢測HOTTIP在HOK和HSC-4細胞中的表達情況， 并研究敲低HOTTIP對HSC-4細胞增殖及遷移的影響， 以期為OSCC的診斷及分子治療提供重要的參考。

1 材料與方法

1. 1 試劑與儀器 HOK和HSC-4細胞獲自American Type Culture Collection（ATCC， Manassas， VA， 美國）， 胎牛血清（FBS）及RPMI1640培養基均購自美國GIBCO公司， Lipofectamine TM 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司， RNA逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒、RNA酶抑制劑、dNTPs SYBR Mastermix均購于大連TaKaRa公司。HOTTIP引物、GAPDH引物均購自Sigma公司。MTT購自美國sigma公司。HOTTIP-inhibitor和Inhibitor-NC購自RiboBio （中國廣州）。主要儀器：細胞培養箱購自美國Thermo公司， Prism 7000型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司， Elx800型全自動酶標儀購自美國Bio Tek公司， 生物分光光度儀購于美國Thermo公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 細胞培養 用含10%FBS的RPMI1640培養基培養細胞， 置于37℃、含5%二氧化碳（CO2）及飽和濕度培養箱中培養。每隔2～3 d換液， 待其達70%～80%融合度時， 可進行后續轉染實驗。

1. 2. 2 qRT-PCR檢測HOK和HSC-4細胞中HOTTIP的表達量 參照說明書進行qRT-PCR檢測HOK細胞和HSC-4細胞中的HOTTIP水平。由上海生工生物工程有限公司設計并合成HOTTIP及內參GAPDH的引物。引物序列：HOTTIP上游：5-CCTAAAGCCACGCTTCTTTG-3， 下游：5-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3;GAPDH上游：5-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3， 下游：5-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3。逆轉錄按照Prime-Script TM逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成互補脫氧核糖核酸（cDNA）， 反應條件：30℃ 10 min， 60℃ 30 min， -80℃保存備用。實時熒光定量PCR按照SYBR Green說明書配制反應體系。取cDNA進行qRT-PCR， 定量PCR條件如下：95℃ 30 min預變性， 然后進行40個循環：95℃ 10 s， 60℃ 20 s， 然后70℃延伸10 s。每個樣品3管重復。根據繪制的標準曲線得到HOTTIP基因以及內參基因GAPDH的相對表達量， 采用2-△△CT計算方法進行統計分析。

1. 2. 3 細胞轉染 將指數生長的HSC-4細胞在含有10%FBS的RPMI1640培養基中培養24 h， 然后用HOTTIP-inhibitor， Inhibitor-NC轉染。根據制造商的方案使用Lipofectamine?2000試劑（Invitrogen?）轉染。用HOTTIP-inhibitor轉染后的細胞被認為是HOTTIP-inhibitor組;用Inhibitor-NC轉染后的細胞被認為是Inhibitor-NC組;未經任何處理的細胞被認為是Control組。轉染48 h后， 使用qRT-PCR進行檢測。

1. 2. 4 MTT檢測 采用MTT法檢測敲低HOTTIP水平對HSC-4細胞增殖的影響。將對數生長期細胞以1×105個接種于96孔板中， 分別于轉染24、48、72、96 h后， 加入5 μg/μl預先配好的MTT溶液20 μl， 孵育4 h后加入二甲基亞砜（DMSO）（150 μl/孔）， 在450 nm波長下檢測各組的吸光度（A值）。以Control組為參考， 計算其余各組A值與Control組的比值以此計為增殖率。實驗重復3次。

1. 2. 5 細胞劃痕實驗 將轉染的HSC-4細胞接種在24孔板中24 h， 然后通過使用10 μl移液管機械傷害細胞并用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）除去碎片。再孵育48 h后， 洗滌孔以除去培養基， 并使用倒置顯微鏡以100X視圖捕獲代表性圖片。使用Image-Pro Plus 6.0記錄和分析傷口區域。實驗重復≥3次。該測定在轉染后48 h進行。

1. 3 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 qRT-PCR檢測HOTTIP的表達量 通過qRT-PCR檢測HOTTIP的表達量， 采用2-△△CT計算方法進行統計， 分析結果顯示HSC-4細胞中的HOTTIP表達量（1.521±0.117）顯著高于HOK細胞的（1.060±0.036）， 差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 HOTTIP-inhibitor轉染及qRT-PCR檢測轉染后HOTTIP的表達量 對HSC-4細胞轉染HOTTIP-inhibitor， qRT-PCR檢測轉染HOTTIP-inhibitor后HOTTIP的表達量， 結果顯示， HOTTIP-inhibitor組HOTTIP表達量（0.336±0.070）均明顯低于Control組的（1.062±0.092）和Inhibitor-NC組的（1.023±0.103）， 差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2. 3 MTT檢測 對HSC-4細胞轉染HOTTIP-inhibitor， MTT實驗證實HSC-4轉染HOTTIP-inhibitor后， HOTTIP-inhibitor組相對于Control組和Inhibitor-NC組， 細胞增殖能力明顯下降， 差異具有統計學意義（P<0.05）， 提示敲低HOTTIP的表達能顯著降低HSC-4細胞的增殖能力。見圖3。

2. 4 細胞劃痕實驗 細胞劃痕實驗中， HOTTIP-inhibitor組細胞的劃痕愈合速度減慢， HOTTIP-inhibitor組轉染后24 h細胞劃痕占比（53.27±1.85）均大于Control組的（21.10±0.78）和Inhibitor-NC組的（25.13±1.69）， 差異均具有統計學意義（P<0.05）， 提示HOTTIP的低表達能有效地降低細胞遷移能力。見圖4， 圖5。

3 討論

起初， lncRNA被認為是基因組轉錄的“噪音”， 不具有任何生物學功能， 隨著研究的逐漸深入， 發現其實lncRNA在疾病學、細胞學等領域是極其具備醫學價值的。現在科學家已經研究出來的lncRNA基因的數量已經達到了5萬左右。越來越多的實踐以及實驗發現， 在各大腫瘤的產生、轉移、發展期間都離不開lncRNAs[8]。其中與腫瘤相關的lncRNA主要有H19、肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1， MALAT-1）、同源異型框基因反義基因間RNA（homeobox antisense intergenic RNA， HOTAIR）、前列腺癌抗原3（prostate cancer antigen 3， PCA3）等。HOTTIP作為lncRNA的一類， 其首次被發現是在人體末梢的成纖維細胞[9]， 其位于7號染色體短臂1區5號帶2亞帶， 即7p 15.2， 其所發生的轉錄其 實是在HOXA13的5 ′端上游300個堿基處， 經5′ 端剪 切成熟后將RNA輸送至胞質內，其所形成的非編碼RNA，核苷酸分子長度為3764個。HOTTIP的重要作用是對機體細胞的新陳代謝進行有效調控， 主要是通過影響Wnt/β-catenin、Bax/Bcl-2等的信號傳導來實現， 當然， 對核染色質發揮修飾作用也是其具有的功能之一， 譬如較為常見的賴氨酸甲基轉移酶就可以通過調控來實現對相關基因表達的掌控[9]。

HOTTIP得到了科學家們的廣泛關注， 其可在肝癌、結腸癌等眾多惡性腫瘤中表現出一定的特異性變化， Quagliata等[10]就對HOTTIP與HOXA13進行了具體的分析， 發現它們在患者體內的含量和患者肝癌病變程度有著密切聯系， 呈現正比狀態;Gu等[11]對患有食管癌的患者進行研究， 尤其是對鱗狀細胞癌患者分析， 發現HOTTIP出現異常的患者生命受損比普通患者更為嚴重， 其生存機會比普通患者要少;Li等[12]與其團隊針對胰腺導管癌和慢性胰腺炎展開研究， 運用基因芯片對患者進行比對證明了患者體內HOTTIP出現的顯著異常， 將癌細胞與周邊細胞間進行對比發現癌細胞所含HOTTIP成分明顯優于周邊細胞;Ye等[13]在對胃癌患者進行剖析時， 也發現了相似的狀況， 相關癌細胞內含有的HOTTIP量均高于其他組織， 且關系著患者病情、腫瘤的尺寸及出現死亡的幾率。目前， HOTTIP是如何參與惡性腫瘤的進展尚不清楚， 其具體作用機制尚未明確， 但無疑其表達量增加是促進腫瘤發生、發展的重要因素之一。

本實驗通過分析， 發現HSC-4細胞中的HOTTIP表達量顯著高于HOK細胞， 這也意味著在OSCC患者病情發展過程中， HOTTIP起著一定的促進作用。本次實驗尚存在一些不足之處， 如缺少對其具體機制的研究， 后期的研究中將進一步通過細胞實驗探討HOTTIP的具體作用機制。

綜上所述， HOTTIP在口腔鱗癌治療過程中有著一定的指導意義， 可有效幫助實現對患者病情的掌控。

參考文獻

[1] Parkin DM， Bray F， Ferlay J， et al. Global cancer statistics， 2002. CA Cancer J Clin， 2005， 55（2）：74-108.

[2] Petti S， Masood M， Scully C. The magnitude of tobacco smoking-betel quid chewing-alcohol drinking interaction effect on oral cancer in South-East Asia. A meta-analysis of observational studies. PLoS One， 2013， 8（11）：e78999.