魯米諾-鐵氰化鉀流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量

劉玉萍，姚悅悅，蔣泳汝，王修中?

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 附屬醫(yī)院，青島266109； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，青島266109)

白藜蘆醇，又稱(chēng)為芪三酚，是一種多酚類(lèi)化合物，其化學(xué)名稱(chēng)為(E)-3，5，4-三羥基二苯乙烯，主要來(lái)源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，是一種天然的抗氧化劑，可以預(yù)防和治療腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病，也可降低血液黏稠度抑制血小板凝結(jié)和預(yù)防癌癥等[1]。目前，測(cè)定白藜蘆醇的方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]和毛細(xì)管電泳法[4]。盡管這些方法具有高的靈敏度，但是所用儀器昂貴，且需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作。因此，需發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏的白藜蘆醇測(cè)定方法。

由丹麥學(xué)者RUZICKA 首次提出的流動(dòng)注射(FIA)方法的運(yùn)用，促進(jìn)了分析過(guò)程的自動(dòng)化，目前已經(jīng)廣泛滲透到分析化學(xué)領(lǐng)域[5]。FIA 可以用較簡(jiǎn)單的試驗(yàn)設(shè)備在廣泛的領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高效率，還能夠通過(guò)單次測(cè)定提供有關(guān)樣品的不同稀釋程度，或樣品與試劑不同混合比例的多維信息[6-7]。與其他光學(xué)測(cè)定方法相比，化學(xué)發(fā)光法無(wú)需復(fù)雜的光路和分光元件，具有靈敏度高和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，普通的實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的試驗(yàn)需求，進(jìn)行組裝，操作簡(jiǎn)單方便[8-11]。目前報(bào)道的化學(xué)發(fā)光體系中，魯米諾是使用最普遍且量子產(chǎn)率較高的化學(xué)發(fā)光試劑之一。在堿性條件下，它可以被多種氧化劑氧化，由基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)，發(fā)出波長(zhǎng)425 nm 的光[12]，但其自身被氧化的反應(yīng)速率較慢或發(fā)光強(qiáng)度較弱，如果有催化劑或增敏劑存在，其發(fā)光強(qiáng)度將大大增強(qiáng)。一些藥物可以作為催化劑或增敏劑，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的直接或間接測(cè)定[13-14]。流動(dòng)注射與化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、容易自動(dòng)化等特點(diǎn)。

白藜蘆醇能夠顯著增強(qiáng)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的強(qiáng)度。因此，本工作結(jié)合流動(dòng)注射，考察了堿性介質(zhì)中白藜蘆醇對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的催化性能，據(jù)此建立了簡(jiǎn)單、快速測(cè)定白藜蘆醇的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法，并將其用于紅葡萄酒中白藜蘆醇含量的測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀；F-4600型熒光光譜儀；CF15RXII型落地離心機(jī)；PK-8D 型電熱恒溫水槽；PB-10型酸度計(jì)；G-2型恒溫加熱磁力攪拌器。

魯米諾儲(chǔ)備溶液:1×10－2mol·L－1，于4 ℃冰箱保存，放置一周，使用時(shí)用1×10－3mol·L－1氫氧化鈉溶液逐級(jí)稀釋。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00×10－3mol·L－1，置于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)適當(dāng)稀釋。

所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 儀器工作條件

儀器包含一個(gè)主泵、一個(gè)副泵、一個(gè)三通閥、一個(gè)混合器和一個(gè)多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，相連的計(jì)算機(jī)上有配套的參數(shù)控制軟件，實(shí)現(xiàn)流動(dòng)注射的進(jìn)樣和化學(xué)發(fā)光信號(hào)的采集。

將8×10－6mol·L－1魯 米 諾 溶 液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液通過(guò)主泵引入系統(tǒng)；由副泵將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液引入系統(tǒng)。三路溶液經(jīng)過(guò)三通閥和一定長(zhǎng)度的管路快速混合均勻后進(jìn)入流通池，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)經(jīng)光電倍增管放大后，由計(jì)算機(jī)記錄并顯示信號(hào)強(qiáng)度。

儀器運(yùn)行參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 儀器運(yùn)行參數(shù)Tab.1 Operating parameters of the instrument

1.3 試驗(yàn)方法

將購(gòu)于當(dāng)?shù)爻械募t葡萄酒樣品經(jīng)減壓抽濾，除去其中的不溶性雜質(zhì)顆粒，然后移取50 m L濾液于燒杯中，加熱至沸騰，持續(xù)2 min(以除去紅葡萄酒中揮發(fā)性芳香物質(zhì))，冷卻至室溫，以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)光反應(yīng)條件的選擇

2.1.1 進(jìn)樣次序

試驗(yàn)考察了8×10－6mol·L－1魯米諾溶液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣次序?qū)Ψ磻?yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明:以8×10－6mol· L－1魯 米 諾 溶 液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液作為載流，將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液注入載流后，可以獲得基線(xiàn)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的化學(xué)發(fā)光曲線(xiàn)。試驗(yàn)中將8×10－6mol·L－1魯米諾溶液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液通過(guò)主泵引入系統(tǒng)，由副泵將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液引入系統(tǒng)。

2.1.2 堿性介質(zhì)

動(dòng)態(tài)電路總共會(huì)涉及滑動(dòng)變阻器類(lèi)型的串聯(lián)電路、滑動(dòng)變阻器類(lèi)型的并聯(lián)電路、開(kāi)關(guān)類(lèi)型的串聯(lián)電路、開(kāi)關(guān)類(lèi)型的并聯(lián)電路四個(gè)基本電路。本文采用從局部→整體→局部的分析方法，對(duì)四個(gè)基本電路進(jìn)行完整、準(zhǔn)確的分析，使學(xué)生能夠全面掌握動(dòng)態(tài)電路中所遇到的問(wèn)題，提高學(xué)生分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力。

魯米諾-鐵氰化鉀體系在堿性介質(zhì)中發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度最大。試驗(yàn)考察了1×10－1，1×10－2，1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液和p H 10的0.01 mol·L－1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液分別作為堿性介質(zhì)時(shí)對(duì)反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明:在1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液中，試驗(yàn)獲得的峰形較好且發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇堿性介質(zhì)為1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液。

2.1.3 魯米諾溶液的濃度

化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度有很大的影響。試驗(yàn)考察了不同濃度的魯米諾溶液對(duì)反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明:隨著魯米諾溶液濃度的增加，反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)魯米諾溶液的濃度大于8×10－6mol·L－1時(shí)，反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的增大程度逐漸減緩，基本趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇魯米諾溶液的濃度為8×10－6mol·L－1。

2.1.4 鐵氰化鉀溶液的濃度

試驗(yàn)考察了不同濃度的鐵氰化鉀溶液對(duì)反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知:隨著鐵氰化鉀溶液濃度的增加，反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度先增大后減小；鐵氰化鉀溶液濃度為2×10－5mol·L－1時(shí)，反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度最大。試驗(yàn)選擇鐵氰化鉀溶液的濃度為2×10－5mol·L－1。

2.2 干擾試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)4.00×10－7mol·L－1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行干擾測(cè)定，結(jié)果表明:當(dāng)相對(duì)誤差在±5%以?xún)?nèi)時(shí)，5 倍的檸檬酸、葡萄糖、抗壞血酸，20倍的Mg2＋、Ca2＋，50倍的淀粉、精糊、乳酸、乙醇，1 000倍的K＋、Na＋、NH4＋、Cl－、NO3－、SO42－均不干擾測(cè)定。

圖1 鐵氰化鉀溶液的濃度對(duì)反應(yīng)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of concentration of potassium ferricyanide solution on chemiluminescence intensity of reaction system

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

圖2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of concentration of resveratrol standard solution on chemiluminescence intensity of the chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

試驗(yàn)結(jié)果表明:白藜蘆醇的線(xiàn)性范圍為1.00×10－8～1.00×10－6mol·L－1，線(xiàn)性回歸方 程為ΔICL＝5.000×109c＋1.728×102(ΔICL為加入白藜蘆醇后反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度與空白溶液發(fā)光強(qiáng)度的差值，c 為白藜蘆醇的濃度)，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，結(jié)果為3.0×10－9mol·L－1。

2.4 精密度試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)4.00×10－7mol·L－1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定11 次，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%。

2.5 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)紅葡萄酒樣品進(jìn)行分析，并對(duì)其進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，樣品分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品分析結(jié)果(n＝6)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝6)

由表2可知:回收率為95.9%～130%。

2.6 化學(xué)發(fā)光機(jī)理

魯米諾的發(fā)光機(jī)理研究較多，普遍認(rèn)為其氧化產(chǎn)物，即激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子為發(fā)光體，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm[15-16]。為了研究魯米諾-鐵氰化鉀體系的反應(yīng)機(jī)理，試驗(yàn)采用熒光光譜儀(關(guān)閉激發(fā)光源)掃描其化學(xué)發(fā)光光譜，見(jiàn)圖3。

由圖3可知:魯米諾-鐵氰化鉀體系和魯米諾-鐵氰化鉀-白藜蘆醇體系的最大發(fā)射波長(zhǎng)均為425 nm，白藜蘆醇的存在僅僅增加了發(fā)光強(qiáng)度，并沒(méi)有產(chǎn)生新的發(fā)光體，因此白藜蘆醇并沒(méi)有改變化學(xué)發(fā)光機(jī)理。白藜蘆醇結(jié)構(gòu)中帶有酚羥基，可以被強(qiáng)氧化劑氧化成激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)的過(guò)程中釋放多余能量轉(zhuǎn)移給基態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子，從而產(chǎn)生更多激發(fā)態(tài)的中間體，返回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

另外，體系中的溶解氧在魯米諾的氧化過(guò)程中也起到了一定的作用，試驗(yàn)對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀-白藜蘆醇體系通氮?dú)獬?5 min，發(fā)現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度降低了約30%。這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明該體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)需要溶解氧的參與。基于以上討論，推測(cè)其反應(yīng)機(jī)理如下(hν 為光子能量):

白藜蘆醇＋O2＋OH－→超氧自由基

超氧自由基＋魯米諾＋鐵氰化鉀 →激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子

激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子 →基態(tài)3-氨基鄰苯二甲酸陰離子＋hν

本工作基于白藜蘆醇對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系具有明顯的增敏作用，將流動(dòng)注射和化學(xué)發(fā)光法結(jié)合為一體，采用魯米諾-鐵氰化鉀流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量。