基于militarine含量結合UPLC指紋圖譜的不同產地白及飲片質量分析*

劉 娜，袁金鳳，彭詩濤，柴沖沖，王靖越，張 凱，李欣欣，李 飛

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488）

白及為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖，具有收斂止血，消腫生肌的功效[1]。白及的主要成分為白及多糖、聯芐類、二氫菲類、菲類、聯菲類、黃酮類等[2-5]，主要有止血、抗菌、抗腫瘤、抗炎鎮痛、促進創傷愈合和抑制黑色素生成等藥理作用[6-10]。2015年版《中華人民共和國藥典》未對白及的質控成分有所規定。現代研究表明，1，4-二 [4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine）具有益智和延緩衰老，防治老年癡呆的功能，且含量較高，是白及中的主要化學成分之一[11-12]。白及主產于華東、中南、西南及甘肅、陜西等地，以貴州產量最大，質量最優，有學者[13-15]對不同產地的白及藥材指紋圖譜進行了研究，結果表明不同產地的白及藥材相似度在0.540～1.000，說明各產地白及藥材質量存在明顯差異。唐修靜等[16]以militarine及浸出物含量為指標，對白及炮制過程中的軟化方法進行研究，結果表明蒸透切片militarine及浸出物含量高于煮透切片和潤透切片。饒文霞等[17]發現白及蒸制后烘干法干燥的白及飲片多糖含量高于真空凍干法，生切片則相反。現行《中華人民共和國藥典》及全國各省市中藥飲片炮制規范收載的白及飲片炮制工藝不盡相同，炮制工藝在一定程度上影響飲片質量。中藥飲片質量與中醫臨床療效密切相關，隨著白及在各領域的廣泛應用，白及飲片的質量控制和評價方法愈來愈重要。目前關于白及的質量研究多側重于原藥材，飲片的研究較少，中藥的療效是多種成分的綜合作用，單一成分往往難以全面反映其內在質量，因此，本研究擬通過測定白及飲片中的militarine含量，結合其指紋圖譜檢測，采用多元統計方法對收集到的不同產地的24批白及飲片進行分析，為白及飲片質量控制提供參考依據。

1 儀器與試劑藥物

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）（美國沃特世科技有限公司，TUV檢測器，Empower色譜工作站）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT-25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Thermo Sorvall Micro 17R微量離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 試劑藥物 militarine（上海同田生物科技有限公司，批號58139-23-4，純度≥98%）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其余試劑均為分析純（北京化工廠）。共收集到5個產地24批白及市售飲片，各樣品來源信息見表1。由北京中醫藥大學中藥學院楊瑤珺教授鑒定為蘭科植物白及干燥塊莖的加工品。

表1 白及飲片樣品產地信息Tab.1 Sample producing areas information of Bletilae Rhizoma slices

2 實驗方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。以乙腈為流動相 A，純水為流動相 B，進行梯度洗脫（0～5 min，2%～6%A；5～7 min，6%～10%A；7～8 min，10%～16%A；8～9 min，16%～19%A；9～14 min，19%～23%A；14～17 min，23%～30%A；17～25 min，30%～31%A；25～26 min，31%A；26～29 min，31%～55%A；29～34 min，55%A）。分析時間34 min，流速0.3 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫46℃，進樣量2 μL，理論塔板數不低于100 000。

2.2 對照品溶液的制備 取militarine對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，搖勻，制成每1 mL含對照品1.6 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取白及飲片，粉碎過4號篩，稱取粉末1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL[18]，稱定質量，超聲處理40 min（功率600 W，頻率40 Hz），放置至室溫，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，10 000 r/min離心10 min，即得。

2.4 含量測定方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取2.2項下militarine對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置 2 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述稀釋后的對照品溶液各2 μL，按2.1項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標（Y），militarine濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程。militarine回歸方程 Y=723 038X-1 883.9，r=0.999 9，militarine在1.617～3.234 μg有良好的線性關系。

2.4.2 精密度實驗 取S1號樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，連續進樣6次，每次2 μL，測定militarine的峰面積，計算RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性實驗 取S1號樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，測定militarine的峰面積，計算RSD為0.15%，表明本方法重復性良好。

2.4.4 穩定性實驗 取S1號樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣 2 μL，測定 militarine 的峰面積，計算RSD為0.29%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 加樣回收率實驗 取已知含量白及飲片粉末 6 份，每份約 0.5 g（militarine 含量 6.86 mg/g），精密稱定，分別精密加入對照品適量，按照2.3項下供試品溶液制備方法制備，2.1項下色譜條件測定militarine的峰面積，計算其含量，結果見表2，平均回收率為101%，RSD為0.70%，表明該方法準確可靠。

表2 militarine加樣回收率（n=6）Tab.2 Sample recovery rate of militarine（n=6）

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度實驗 取S1號樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，連續進樣6次，每次2 μL。測得各共有峰相對保留時間RSD小于0.45%，相對峰面積RSD小于3.69%，相似度大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性實驗 取S1號樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，每次進樣2 μL。測得各共有峰相對保留時間RSD小于0.48%，相對峰面積RSD小于4.68%，相似度大于0.989，表明此方法重復性良好。

2.5.3 穩定性實驗 取S1號樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣 2 μL，測得各共有峰相對保留時間RSD小于0.97%，相對峰面積RSD小于3.88%，相似度大于0.993，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 測定方法 取白及飲片樣品，按照2.3項下供試品溶液制備方法制備，分別量取對照品溶液和供試品溶液2 μL，按2.1項下色譜條件測定，即得。對照品及樣品色譜圖見圖1。

3 實驗結果

3.1 含量測定結果 取白及飲片樣品，按照2.6項下測定方法測定，計算樣品含量，militarine含量測定結果見表3。

3.2 白及飲片指紋圖譜的建立 取24批不同產地白及飲片，按照2.3項下方法制備供試品溶液，采用2.1項下色譜條件進行檢測。將得到的24個色譜圖導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012.1版）軟件進行處理。由于S1號樣品的色譜峰分離度和峰型較好，且基線穩定，故選擇S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，選用平均數法，多點校正后進行全譜峰匹配，并生成白及飲片對照圖譜（R）。24批白及飲片UPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜分別見圖2、3。

根據匹配結果得出，24批白及飲片共識別出12個共有峰。其中9號峰（17.111 min）為所有樣品共有，且分離度較好，峰位相對居中，峰面積較大，與對照品比對，此峰為白及中聯芐類成分之一，1，4-二 [4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine），故以此峰作為參照峰計算其余共有峰的相對峰面積和相對保留時間。不同產地白及飲片的各共有峰相對保留時間RSD在0%～3.72%之間，各共有峰相對峰面積RSD在0%～76.96%之間。

3.3 白及飲片指紋圖譜結果分析

3.3.1 相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012.1版）軟件，以平均數法，時間窗為0.1，以S1樣品為參照圖譜，計算各樣品的相似度，結果見表4。

3.3.2 聚類分析 以24批白及飲片指紋圖譜中12個共有峰標準化處理后的峰面積作為變量，采用SPSS 22.0統計分析軟件，運用組間聯接法，選取平方Euclidean距離作為度量標準對樣品進行系統聚類，結果見圖4。結果顯示24批樣品可分為四大類，其中 S9、S16、S17、S18、S8、S14 等 6 個樣品聚為一類，S20、S21分別獨自聚為一類，其余16個樣品聚為一類。

圖1 對照品及樣品的色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of reference and samples

表3 militarine含量測定結果（±s，n=3）Tab.3 Resultsofmilitarinecontentdetermination（±s，n=3）

表3 militarine含量測定結果（±s，n=3）Tab.3 Resultsofmilitarinecontentdetermination（±s，n=3）

編號 militarine含量 編號 militarine含量S1 28.66±0.01 S13 24.44±0.02 S2 31.87±0.01 S14 37.25±0.01 S3 21.96±0.00 S15 18.98±0.01 S4 25.25±0.01 S16 39.81±0.02 S5 30.31±0.00 S17 41.91±0.00 S6 27.77±0.01 S18 33.80±0.00 S7 20.33±0.01 S19 29.93±0.01 S8 44.87±0.01 S20 39.41±0.01 S9 43.17±0.02 S21 41.85±0.01 S10 23.15±0.00 S22 34.35±0.01 S11 32.99±0.01 S23 31.45±0.01 S12 25.49±0.01 S24 22.64±0.02

3.3.3 主成分分析 主成分分析法是一種從眾多原始指標之間相互關系入手，尋找少數綜合指標以概括原始指標信息的多元統計方法，可以充分利用已有的數據信息進行綜合分析。運用SPSS 22.0軟件對24批不同產地白及飲片指紋圖譜中共有峰的峰面積作為變量進行主成分分析。KMO和Bartlett球形檢驗結果表明，KMO為0.698，說明數據適合做因子分析。以特征值應大于1為依據，提取了3個主成分，3個主成分的方差貢獻率分別是55.108%、19.154%、8.644%，累積方差貢獻率是82.907%，3個特征值分別是 6.613、2.299、和 1.037。

24批白及飲片成分矩陣見表5。第1主成分的主要信息來自色譜峰10，第2主成分的主要信息來自色譜峰7，第3主成分的主要信息來自色譜峰6，其中9號峰為militarine。主成分結果表明色譜峰6、7、10均為關鍵成分，而現有市場難以買到白及其他標準品，無法對這3個關鍵成分進行定性，故采用分別計算其相對mitarine含量的方法進行進一步分析，并計算各批次樣品中這3個化合物以及militarine共4個關鍵成分的總相對含量，結果見表6。

圖2 24批白及飲片指紋圖譜和對照圖譜Fig.2 The UPLC fingerprintand control map of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

圖3 白及飲片對照指紋圖譜Fig.3 Control fingerprint of Bletilae Rhizoma slices

表4 24批不同產地白及飲片相似度Tab.4 Similarity of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices from different producing areas

圖4 24批白及飲片指紋圖譜聚類樹狀關系Fig.4 Cluster tree diagram of fingerprint of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

根據主成分得分，運用SPSS 22.0軟件進行3-D散點圖進行分類，分析結果見圖5。主成分分析分類結果表明，S8、S9、S14、S16、S17、S18、S19 等 6 個樣品聚為一類，S20、S21分別聚為一類，其余16個樣品聚為一類。主成分分析分類結果與聚類分析結果基本一致，從而驗證了聚類分析結果的可靠性。

4 討論

本研究參照相關文獻[18-19]對提取方式和提取溶劑進行考察，發現其供試品溶液的制備均采用回流提取的方式，未對超聲提取進行考察，且提取溶劑多為50%甲醇，基于此本研究考察了回流和超聲兩種提取方式以及不同濃度甲醇（40%、50%、60%、70%）作為提取溶劑對指紋圖譜的影響，發現以50%甲醇超聲提取方式制備的樣品指紋圖譜整體峰形較好。同時本實驗通過對223 nm[20]，270 nm[14]和280 nm[18]3種吸光度下白及飲片指紋圖譜進行對比分析，發現當吸光度為270 nm時，militarine峰形較好，且指紋圖譜峰數目較多，能更為全面的反映白及飲片整體信息。

圖5 主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis diagram

表5 24批白及飲片成分矩陣Tab.5 Composition matrix of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

研究表明，24批白及飲片militarine含量在18.98～44.87 mg/g之間，其中 S15（貴州）含量低于20.00 mg/g；S8（湖北）與S9（貴州）、S17（湖北）、S21（陜西）4個批次含量高于40.00 mg/g，其余19個批次含量均在20.00～40.00 mg/g之間，表明不同批次的白及飲片militarine含量存在一定的差異。

通過相似度比較，24批白及飲片指紋圖譜相似度在0.812～0.976之間，除S14與S15兩批樣品相似度低于0.9，其余各批次飲片與對照圖譜的相似度均在0.9以上，占樣品數的92%，表明24批白及飲片的整體質量基本穩定。S14樣品militarine含量高達37.25 mg/g，相似度結果僅為0.822，表明單一成分含量高低與相似度大小的分析結果不一致。

表6 白及飲片中4種關鍵成分的相對含量Tab.6 Relative content of four key components in Bletilae Rhizoma slices mg/g

以12個共有峰峰面積進行聚類，結果顯示24個樣本可分為 4 類，編號為 S9、S16、S17、S18、S8、S14的6個批次樣品聚為一類，S20、S21分別聚為一類，其余16個批次樣品的militarine含量和指紋圖譜中4個關鍵成分的總相對含量均較低，聚為一類。主成分分析結果表明不能以單一成分評價飲片質量，且其分類結果與聚類分析結果一致，與相似度大小關系不大。

5 結論

綜上，本研究建立了白及飲片中militarine含量的測定方法，同時建立了白及飲片UPLC指紋圖譜。通過運用成分測定、指紋圖譜結合化學計量學對不同產地的24批白及飲片進行分析，從單一成分到多個成分含量，再到總體相似度，從多維度分析，認為以其主要成分mitarine含量結合指紋圖譜對白及飲片質量進行評價，具有一定的科學性和可行性，為白及飲片質量標準的制定提供了參考依據。