GP73預(yù)測慢性乙型肝炎患者肝硬化進(jìn)展研究

劉沁雨，常 越，張 文，張 青，盧誠震，李 海

目前，全球約有3億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，我國慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者人口基數(shù)較大，平均死亡年齡約為59.8歲。死亡原因主要是終末期肝臟疾病，如失代償期肝硬化、肝衰竭、肝細(xì)胞癌等[1]。有研究報(bào)道，20%～30%的HBV患者可進(jìn)展至肝硬化，在中國超過84%的肝細(xì)胞癌是由HBV引起的[2]。但現(xiàn)有抗病毒治療對于絕大多數(shù)患者較難達(dá)到理想治愈，僅能夠延緩疾病進(jìn)程，無法完全避免終末期肝臟疾病的發(fā)生。目前，除肝臟活組織檢查這一有創(chuàng)檢測手段診斷肝臟疾病進(jìn)程外，血清無創(chuàng)檢測也越來越受到醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注，GPR無創(chuàng)診斷模型是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種診斷肝硬化的模型[3]。但研究表明，相比血清模型，血清中特異蛋白的診斷對肝臟疾病進(jìn)程可能更加敏感,如血清高爾基體蛋白73(golgi protein 73，GP73)是近年來用于肝細(xì)胞癌診斷的新指標(biāo)，后期研究發(fā)現(xiàn)其與肝硬化的發(fā)展也存在良好相關(guān)性[4，5]。因此，本研究重點(diǎn)分析血清GP73在抗病毒治療慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎肝硬化患者中的表達(dá)差異，探討血清GP73濃度對慢性乙型肝炎肝硬化患者的診斷價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018年1-12月在武警特色醫(yī)學(xué)中心肝膽胰脾科就診已進(jìn)行長期抗病毒治療的慢性乙型病毒性肝炎患者。經(jīng)初篩實(shí)驗(yàn)隊(duì)列納入188例，排除81例，最終入組107例，其中男性72例，女性35例，年齡(52±11.55)歲。根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》同時(shí)參考臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合考慮，將入組患者分為慢性乙肝組(59例)和慢性乙肝肝硬化組(48例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清HBsAg陽性超過6個(gè)月；(2)肝硬化診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)均進(jìn)行抗病毒治療，療程超過2年；(4)無惡性腫瘤病史；(5)年齡在18～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、其他病毒性肝炎等；(2)伴有心腦腎重要臟器疾病者；(3)妊娠或哺乳期婦女；(4)伴有血液疾病，如嚴(yán)重貧血等；(5)血液樣本出現(xiàn)溶血等不良情況。

另選取2018年8-11月就診于天津市第二人民醫(yī)院肝病科的慢性乙型肝炎患者。經(jīng)初篩驗(yàn)證隊(duì)列納入158例，排除25例，最終入組133例，其中男性95例，女性38例，年齡(56.83±10.79)歲。采取相同方法將入組患者分為慢性乙肝組(97例)和慢性乙肝肝硬化組(36例)。納入排除標(biāo)準(zhǔn)同上。所有患者及家屬了解研究內(nèi)容并簽署知情同意書，該研究獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(臨科2016-0041.2)。

1.2 方法

1.2.1 基本資料 收集患者人口學(xué)資料，包括年齡、性別；實(shí)驗(yàn)室資料，包括總膽紅素(total bilirubin,TBil)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(glutamyltransferase,GGT)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count,PLT)。生化分析采用西門子全自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)測定，PLT采用希森美康xs-1000i的血液細(xì)胞分析儀測定。

1.2.2 GPR 無創(chuàng)血清學(xué)診斷模型計(jì)算公式:GPR=(GGT/ULN)×100/PLT(109/L)[3]。

1.2.3 血清GP73 含量測定收集患者當(dāng)日1 ml血清樣本并凍存于-80 ℃冰箱。血清GP73濃度測定采用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法，實(shí)驗(yàn)流程按照試劑盒(海南眾森生物科技有限公司)提供的說明書嚴(yán)密進(jìn)行。所有血清樣本統(tǒng)一于2019年1月及3月分別進(jìn)行測定，所有測定指標(biāo)均重復(fù)3次，無異常波動(dòng)結(jié)果被認(rèn)為是準(zhǔn)確的。

1.2.4 測定肝硬度值 入組患者肝硬度(liver stiffness measurement,LSM)值測定由本院具有10年操作經(jīng)驗(yàn)的同一彩超醫(yī)師完成。患者取仰臥位，右臂高舉過頭，使肝區(qū)肋間隙充分暴露，選擇右側(cè)第7、8、9肋間，將涂有耦合劑的換能探頭緊貼肋間隙選取適當(dāng)時(shí)機(jī)測定LSM值。最后檢測結(jié)果需至少成功測定10次并取中位數(shù)，同時(shí)還需滿足四分位間距 (interquartile range，IQR)小于中位數(shù)的30%和成功率大于65%的要求[6]。

2 結(jié) 果

2.1 試劑盒產(chǎn)品性能分析 經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)測量計(jì)算得出本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r均>0.99，線性關(guān)系良好，批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)≤15%，批間重復(fù)性變異系數(shù)≤15%，即本試劑盒可靠。

2.2 兩組隊(duì)列患者基本資料比較 分析將可能影響乙肝肝硬化發(fā)生的基本資料進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)隊(duì)列結(jié)果顯示：乙肝肝硬化組年齡、TBil、ALP、PLT、LSM、GPR、GP73數(shù)值明顯高于乙肝組，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

驗(yàn)證隊(duì)列結(jié)果顯示：乙肝肝硬化組年齡、TBil、AST、ALP、GGT、PLT、LSM、GPR、GP73數(shù)值明顯高于慢性乙肝組，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

將實(shí)驗(yàn)隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列基本資料進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組隊(duì)列為病情有所差別的非同質(zhì)隊(duì)列，但其臨床診斷準(zhǔn)確(表1)。

表1 慢性乙肝肝硬化兩隊(duì)列患者主要特點(diǎn)比較 (n；%)

2.3 血清GP73含量與肝臟炎癥程度及發(fā)生肝硬化的相關(guān)性 對實(shí)驗(yàn)隊(duì)列兩組患者血清GP73濃度與ALT、AST、TBil進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)GP73濃度與其具有相關(guān)性(ALT：r=0.244，P=0.012；AST：r=0.373，P=0.000；TBil：r=0.451，P=0.000)，將兩組患者血清GP73濃度與是否發(fā)生肝硬化進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性(r=0.846，P=0.000)。對驗(yàn)證隊(duì)列做相同分析發(fā)現(xiàn)此隊(duì)列中GP73濃度與ALT、AST、TBil濃度具有相關(guān)性(ALT：r=0.226，P=0.010；AST：r=0.505，P=0.000；TBil：r=0.532，P=0.000)，與發(fā)生肝硬化同樣具有相關(guān)性(r=0.591，P=0.000，圖1)。

圖1 兩隊(duì)列慢性乙肝組和慢性乙肝肝硬化組GP73濃度與ALT、AST、TBil濃度的Pearson相關(guān)性分析

2.4 血清GP73含量對肝硬化的診斷價(jià)值 通過將兩組隊(duì)列的GP73、GPR、LSM值嘗試構(gòu)建乙肝肝硬化診斷的ROC曲線，實(shí)驗(yàn)隊(duì)列結(jié)果顯示：各指標(biāo)診斷乙肝肝硬化的曲線下面積分別為LSM(AUC1=0.844)、GPR(AUC1=0.922)、GP73(AUC1=0.991)。各項(xiàng)指標(biāo)相比，GP73AUC最高，其最佳診斷點(diǎn)為3.65 μg/L，特異性為100%，敏感性達(dá)93.2%。

驗(yàn)證隊(duì)列結(jié)果顯示：LSM(AUC2=0.730)、GPR(AUC2=0.724)、GP73(AUC2=0.870)。GP73AUC最高，其最佳診斷點(diǎn)為3.67μg/L，特異性為83.3%，敏感性達(dá)87.6%。對比幾種檢測方法正確率可發(fā)現(xiàn)兩組結(jié)果均顯示GP73對診斷乙肝肝硬化正確率明顯高于其余兩種方法(圖2)。

3 討 論

目前，全球CHB患病率呈逐年下降趨勢，但由于前期患病人口基數(shù)較大，我國仍有9300萬HBV感染者[7，8]。臨床上常用的檢測肝臟疾病進(jìn)展手段包括有創(chuàng)和無創(chuàng)檢測，但上述檢測方法都存在一定的局限性[9]。為彌補(bǔ)這一局限性，Lemoine等[10，11]構(gòu)建了GPR模型。后續(xù)研究表明，GPR模型優(yōu)于指南推薦的APRI等無創(chuàng)血清學(xué)模型。Kladney等[12]研究巨細(xì)胞性肝炎時(shí)發(fā)現(xiàn)了GP73。正常肝組織中GP73在肝細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)，但學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者的肝細(xì)胞中GP73表達(dá)上調(diào)，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)使GP73成為預(yù)測肝癌發(fā)生的新興無創(chuàng)指標(biāo)。后續(xù)對良性肝臟疾病進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，患者肝細(xì)胞和血清中也可出現(xiàn)高表達(dá)的GP73，且其濃度隨肝臟疾病嚴(yán)重程度上升[13]。因此，GP73和肝臟疾病的相關(guān)性引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本研究通過對血清GP73濃度分析，研究其對于診斷CHB及其相關(guān)肝硬化是否具有可行性。

本研究通過對CHB和CHB肝硬化患者比較發(fā)現(xiàn)，兩隊(duì)列中年齡、肝臟炎癥程度指標(biāo)、總膽紅素存在明顯差異。這表明隨著年齡增長，病毒侵犯時(shí)間延長，肝臟炎癥程度加重，肝纖維化逆轉(zhuǎn)率降低，使得老年患者更易進(jìn)展至肝硬化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩組隊(duì)列肝硬化患者GPR(P1=0.000，P2=0.000)、LSM(P1=0.000，P2=0.000)、GP73(P1=0.000，P2=0.026)都明顯高于CHB患者。LSM是目前運(yùn)用最為廣泛的無創(chuàng)影像學(xué)診斷指標(biāo)，同時(shí)也是指南中推薦的無創(chuàng)診斷方法之一，但其易受患者總膽紅素、體型等外界因素影響。GPR模型是近年來新提出的血清無創(chuàng)診斷模型，其主要由GGT和PLT比值進(jìn)行判斷，黃春明等[14，15]的研究和本研究兩組隊(duì)列的GPR都反映出CHB和肝硬化患者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究選取兩家醫(yī)院的研究結(jié)果，雖患者病情有所差異，但經(jīng)研究表明GP73在診斷CHB肝硬化的方面具有一定可行性。肝硬化患者GP73濃度與肝臟受損程度密切相關(guān)，筆者認(rèn)為相較于CHB患者，肝硬化患者肝臟受到炎癥因子的侵襲更為嚴(yán)重，肝細(xì)胞受損更為明顯，在肝細(xì)胞受損的同時(shí)其釋放了大量GP73進(jìn)入血清，導(dǎo)致肝硬化患者血清中GP73濃度高于CHB患者[16，17]。同樣樂萍等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，在肝硬化患者中血清GP73濃度較CHB患者明顯升高。

圖2 不同血清無創(chuàng)診斷對慢性乙型病毒性肝炎肝硬化的診斷價(jià)值

AB圖為GPR、LSM、GP73對診斷慢性乙型病毒性肝炎肝硬化的ROC曲線，CD圖為采用三種診斷方法后每種方法對診斷慢性乙型病毒性肝炎和肝硬化的準(zhǔn)確率

臨床上ALT、AST都是反映肝損害的重要血清學(xué)指標(biāo)，研究表明轉(zhuǎn)氨酶隨肝臟疾病嚴(yán)重程度而升高[1,19]。雖然本研究顯示兩組隊(duì)列中患者ALT并無明顯差異，經(jīng)分析可能與肝硬化患者長期服用抗病毒藥物，進(jìn)而促使患者肝炎程度差異不明顯有關(guān)。本研究通過將兩組隊(duì)列中的血清GP73與轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、是否發(fā)生肝硬化進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清GP73與其均具有相關(guān)性，其中與是否發(fā)生肝硬化密切相關(guān)(r1=0.846，P1=0.000；r2=0.591，P2=0.000)，Cao等[20]的研究也有類似結(jié)果。血清GP73能反映肝臟炎癥程度和肝細(xì)胞受損程度。雖然目前血清GP73在乙肝肝硬化疾病中的作用機(jī)理尚不清楚，但研究表明高表達(dá)的GP73可促使細(xì)胞增殖和肝細(xì)胞再生，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)GP73可在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)，加速肝纖維化進(jìn)程，相比轉(zhuǎn)氨酶等肝臟炎性反應(yīng)程度指標(biāo)，GP73濃度可隨肝纖維化分期而升高。因此基于文獻(xiàn)[21-24]研究和本研究發(fā)現(xiàn)筆者認(rèn)為GP73可以作為反映肝臟纖維化嚴(yán)重程度的一個(gè)參考指標(biāo)。

ROC曲線可以較全面高效的評(píng)判診斷指標(biāo)，因此本研究將GPR模型、血清GP73、LSM值診斷肝硬化的可行性進(jìn)行了ROC曲線的繪制。結(jié)果表明三種無創(chuàng)檢測手段對診斷肝硬化都具有較高的診斷價(jià)值，GP73在實(shí)驗(yàn)隊(duì)列中當(dāng)血清濃度達(dá)3.65 μg/L(AUC1=0.991)、驗(yàn)證隊(duì)列達(dá)3.67 μg/L(AUC2=0.870)時(shí)，對鑒別CHB患者是否進(jìn)展至肝硬化具有較高的特異性和敏感度(特異度1=100%，敏感性1=93.2%；特異度2=83.3%，敏感性2=87.6%)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)GPR模型(AUC1=0.922，AUC2=0.724)、傳統(tǒng)FibroScan診斷即LSM值(AUC2=0.844，AUC2=0.730)對診斷肝硬化相較于GP73這一新型無創(chuàng)檢測手段其準(zhǔn)確性有所下降。通過對三種無創(chuàng)指標(biāo)診斷正確率計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，不論對CHB還是肝硬化患者GP73檢測的正確率最高，由此筆者認(rèn)為血清GP73具有診斷CHB肝硬化的應(yīng)用條件，在臨床上可能給醫(yī)生提供了又一個(gè)較好監(jiān)測指標(biāo)。

本研究雖收集了兩家中心醫(yī)院的樣本，但最終入組患者樣本較少，同時(shí)需要指出的是本研究入選患者因進(jìn)行了抗病毒治療導(dǎo)致大多患者轉(zhuǎn)氨酶小于2倍正常值，但通過個(gè)別數(shù)據(jù)筆者研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶過高可能會(huì)影響研究結(jié)果，因此GP73在轉(zhuǎn)氨酶大于2倍正常值患者中對肝硬化診斷的準(zhǔn)確性有待后續(xù)進(jìn)一步研究。肝臟病理活檢是判斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)，但因患者意愿、經(jīng)濟(jì)能力等原因未能對入組患者全部進(jìn)行肝臟病理活檢。

綜上所述，血清中GP73的濃度與乙肝肝臟疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。當(dāng)其濃度達(dá)到3.65 μg/L左右時(shí)，提示患者有進(jìn)展至肝硬化的可能。臨床醫(yī)生應(yīng)密切觀察患者病情進(jìn)展，提前干預(yù)，降低患者進(jìn)展至終末期肝臟疾病的可能性。GP73濃度通常可以采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，操作方便、性價(jià)比較高，受用范圍較廣，特別是對于醫(yī)療條件欠發(fā)達(dá)地區(qū)，GP73檢測是一高性價(jià)比的檢測診斷手段。