江蘇地區小麥赤霉病菌種群檢測與抗藥性分析

周華飛 ，吳佳文，楊紅福，陳宏州，束兆林，饒 斌，朱建飛，姚克兵

（1江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212400；2江蘇省植物保護植物檢疫站，南京 210036）

0 引言

小麥作為最主要的糧食作物之一，在全球的種植面積達到2.2 億～2.4 億hm2，占谷物總產量的29%[1-2]。小麥赤霉病(wheat head blight)是威脅小麥糧食生產的主要病害之一，受氣候變化和秸稈還田耕作制度影響，小麥赤霉病在北美和歐洲的危害不斷加重[3-4]。小麥赤霉病是由鐮孢菌(Fusarium)引起的一種真菌病害，在小麥揚花期和降雨等空氣濕度大的氣候條件下進行病原菌侵入，在中國主要危害江蘇安徽等長江中下游麥區，平均年份減產13%左右，重災年份減產可達50%，嚴重威脅國內小麥糧食生產[5]。在中國，鐮孢菌主要存在：禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、亞細亞鐮孢（Fusarium asiaticum，又名亞洲鐮孢）、黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)、梨孢鐮孢(Fusarium poae)和雪腐鐮孢(Microdochium nivale)等15種[6-10]，其中禾谷鐮孢和亞細亞鐮孢占據絕對優勢地位[11-12]。江蘇省內禾谷鐮孢主要分布于年平均氣溫低于15℃的淮北地區，而亞細亞鐮孢主要分布于年平均氣溫高于15℃的淮南地區[13]。江蘇地區小麥赤霉病主要的致病菌為亞細亞鐮孢，其次為禾谷鐮孢菌，其余的病原菌種類報道甚少[14]。

目前生產上對于小麥赤霉病的防治主要依靠種植抗病品種和使用化學藥劑為主，在揚花期空氣濕度大等發病較重年份，化學防治依舊是解決小麥赤霉病的主要手段[15-16]。隨著田間發現多菌靈單劑抗藥性的逐漸上升，其復配制劑逐步取代單劑成為一段時間內小麥赤霉病化學防治的主力藥劑[17-20]。此外，三唑類殺菌劑戊唑醇和咪唑類殺菌劑咪鮮胺等低毒廣譜高效的小麥赤霉病防治藥劑也占據重要的市場份額，且逐步取代多菌靈等較老的殺菌劑[21-23]。本研究首先采用LAMP-PCR[24-27]技術檢測江蘇地區多種小麥赤霉病菌的優勢種群，明確小麥赤霉病菌的遺傳進化構成，檢測了小麥赤霉病菌對多菌靈、戊唑醇和咪鮮胺的抗藥性情況，以期為科學研究江蘇地區小麥赤霉病的化學藥劑防治提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

多菌靈(5、10 μg/mL)、戊唑醇(5 μg/mL)和咪鮮胺(5 μg/mL)均為原藥稀釋配制，由江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所植保研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗條件及設計 本研究越冬稻樁取樣地點為江蘇省鹽城市、溧陽市和通州市，共計15 份。本試驗于江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所實驗室進行室內子囊孢子的鑒定與抗藥性檢測。刮取每份樣品稻樁上黑色子囊殼部分溶解于無菌水中，使用血球計數板檢測子囊孢子濃度，并稀釋合理倍數至每個PDA[28-29]培養皿(9 cm)中萌發出10～20個赤霉病菌單菌落，挑取赤霉病單菌落菌絲于另一個培養皿中培養至鋪滿整個培養皿為止。刮取PDA培養基表面上全部菌絲于2 mL離心管中，液氮條件下使用磨樣機磨成粉狀物，提取該菌落的全基因組DNA。全基因組DNA提取采用北京全式金生物技術公司產品EasyPure Plant Genomic DNA Kit 完成。LAMP-PCR 技術體系（上海生工生物工程有限公司等溫擴增PCR 混合液（通用型））、檢測目標病原菌、靈敏度與引物序列如表1 所示。本研究PCR體系(25 μL)如下：2×Lamp Master Mix，12.5 μL；FIP(10 μmol/L)，2 μL；BIP (10 μmol/L)，2 μL；L B(10 μmol/L)，1 μL；F3 (10 μmol/L)，0.5 μL；B3(10 μmol/L)，0.5 μL；DNA，25～100 ng；DNA Polymerase，0.5 μL；ddH2O，補足至25 μL。檢測方法為瓊脂糖電泳檢測，顯示不同大小條帶組成的LAMP特征圖譜。

本研究設置小麥赤霉病殺菌劑終濃度多菌靈是5 μg/mL 和10 μg/mL，戊唑醇是5 μg/mL，咪鮮胺是5 μg/mL。將上述3 個地區采集的稻樁黑色子囊殼刮取和碾碎混勻，加入2 mL 無菌水稀釋，利用血球計數板在顯微鏡下檢測子囊孢子濃度，加入無菌水稀釋至合理倍數，使之在對照組每個PDA 培養皿(9 cm)中萌發出的小麥赤霉病原菌菌落數位于10～20 cfu，同時吸取等量混勻孢子液涂布于含有上述終濃度的殺菌劑PDA培養皿中，對照組和處理組萌發菌落清晰明顯之后進行分別計數。每個終濃度殺菌劑PDA平板重復5次。

表1 LAMP-PCR技術體系、檢測目標病原菌、靈敏度與引物序列

1.2.2 調查項目及方法 本研究子囊孢子的類群鑒定LAMP-PCR 電泳特征圖譜為鑒定依據并計數。子囊孢子對3種殺菌劑的抗性頻率計算見公式(1)。

2 結果與分析

2.1 小麥赤霉病菌優勢種群鑒定

本研究將采自于江蘇通州、鹽城和溧陽地區的15個取樣點共計75 份樣品分別利用LAMP-PCR 技術鑒定了培養皿中單菌落的病原菌混合類群，鑒定了亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢的電泳圖像，如圖1所示，圖中1～15號陽性條帶為亞細亞鐮孢，16-17號陽性條帶為禾谷鐮孢，均由不同大小的片段組成混合條帶，介于100～750 bp之間，不包含上述2種優勢致病類群的單菌落18號則無擴增條帶。上述75 份樣品中亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢檢測結果如表2所示，亞細亞鐮孢在75份樣品中均有檢出，占比達到100%；禾谷鐮孢在江蘇3 個地區的檢出率平均值僅為11.3%；亞細亞鐮孢為江蘇3個地區小麥赤霉病菌的優勢種群。

表2 江蘇通州、鹽城和溧陽地區赤霉病菌優勢種群統計

2.2 小麥赤霉病菌子囊孢子抗藥性頻率檢測

江蘇3 個地區取樣分離的子囊孢子對多菌靈(5、10 μg/mL)、戊唑醇(5 μg/mL)和咪鮮胺(5 μg/mL)殺菌劑的抗藥性頻率檢測如表3 所示，江蘇通州地區子囊孢子對多菌靈(5 μg/mL)抗性頻率最高，達到54.5%，對多菌靈(10 μg/mL)抗性頻率也顯著高于其他2 個地區的抗性水平；江蘇鹽城和溧陽地區的小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性頻率稍低；江蘇3 個地區均未檢測到對戊唑醇(5 μg/mL)和咪鮮胺(5 μg/mL)具有抗藥性的病原菌；江蘇3 個地區對多菌靈均已產生較嚴重的抗藥性，平均值達到38.5%，說明多菌靈單劑已不適合在上述江蘇地區作為小麥赤霉病防治藥劑使用。

3 討論與結論

在影響國內小麥糧食生產的真菌病害范圍內，小麥赤霉病已逐步成為危害最嚴重的病害，其分泌的嘔吐毒素超標嚴重可直接導致人畜腹瀉[32-33]。小麥赤霉病主要發生在長江中下游麥區，近些年來逐步北移至淮河以北的山東河南境內，對其防控的壓力逐年增加[34-36]。小麥赤霉病的防控主要依靠化學殺菌劑，多菌靈等較老藥劑單劑已無法有效控制其擴展，抗藥性逐年增強，三唑類和咪唑類殺菌劑及其各自復配制劑正在成為主力藥劑[16-21,37-40]。本研究以江蘇溧陽、通州和鹽城3 個地區采集的小麥赤霉病樣品為試材，通過檢測樣品中包含的亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢比例來確定小麥赤霉病菌在江蘇地區的優勢生理小種。檢測結果中亞細亞鐮孢的占比是100%，為優勢小種，禾谷鐮孢的占比僅有11.33%，與許苗等[27]的報道結果基本一致。本研究以上述地區樣品分離的子囊孢子單菌落為試材，檢測了對多菌靈、戊唑醇和咪鮮胺的抗性情況，結果顯示對多菌靈抗藥性頻率介于26.3%～54.5%之間，屬于嚴重抗藥性，多菌靈單劑基本喪失對小麥赤霉病的控制效果，與宋益民等[16]報道結果基本一致。本研究未檢測到對戊唑醇和咪鮮胺單劑產生抗藥性的赤霉病菌株，未發現對上述2 種藥劑產生抗藥性，與高啟迅[41]的報道結果一致，但周仁先已在自然界采集到對戊唑醇具有抗性的赤霉菌株，說明赤霉病菌對戊唑醇單劑已部分產生抗藥性，本研究未檢測到上述菌株可能原因是用藥地域和時間上的差別，或是檢測的菌株群體數量不足和藥劑濃度過高導致的。

表3 江蘇通州、鹽城和溧陽地區赤霉病菌抗藥性頻率檢測 %

傳統上的小麥赤霉病菌組織分類學要求分離病原菌獲取單孢，依靠形態學等手段進行鑒定，該方法耗時多、成本高和可靠性低。隨著分子生物學的快速發展與應用，常規PCR逐漸應用于檢測小麥赤霉病菌的種群組成，該方法較組織分類學更簡單快速，準確度更高，但該方法嚴重依賴于引物的特異性，且檢測周期仍舊偏長[42]。LAMP-PCR技術較組織分類學和常規PCR技術具有特異性和靈敏度最高、檢測周期最短以及肉眼可觀察等特點，成為小麥赤霉病菌快速檢測的最佳方法，但該方法也存在明顯不足，不能同時進行多重靶標位點的檢測，需要嚴格無菌操作避免污染，定量分析能力不如qRT-PCR等，綜合所有因素來說該方法是到目前為止小麥赤霉病菌快速鑒定的最佳方法[43-45]。本研究采用LAMP-PCR 技術完成了對江蘇地區小麥赤霉病菌優勢種群的鑒定，亞細亞鐮孢成為優勢生理小種，結果準確可靠，但本研究存在一定的不足，例如取樣地區和試材數量仍舊偏少，要準確獲取江蘇地區小麥赤霉病的群體遺傳和抗藥性情況，還需要檢測除亞細亞鐮孢和禾谷鐮孢之外的其他生理小種的數量。本研究采用的LAMP-PCR 技術依舊僅限于在實驗室獲取最終結果，無法在田間應用，未來需要開發可直接應用于田間快速鑒定小麥赤霉病菌的免疫ELISA 試劑盒。

綜上，本研究明確了江蘇通州、鹽城和溧陽地區小麥赤霉病優勢種群是亞細亞鐮孢，禾谷鐮孢占比較低；同時檢測到上述地區小麥赤霉病菌對多菌靈單劑抗性嚴重，基本喪失防治效果；未檢測到對戊唑醇與咪鮮胺單劑具有抗性的赤霉菌株，說明在一段時間內戊唑醇和咪鮮胺單劑及其復配制劑對小麥赤霉病仍具有較好防效。